PLCZ1基因突變患者配偶經(jīng)卵母細胞輔助激活妊娠1例并文獻復習

張坤，王躍，曹金鳳，許秀華，郝桂敏

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院生殖醫(yī)學科，石家莊 050000)

一、病例資料

患者，女，29歲，因“結(jié)婚6年，未避孕未孕”于2015年8月3日就診。平素月經(jīng)周期規(guī)律，月經(jīng)3～5 d/28～30 d，孕0產(chǎn)0，既往體健。女方5年前行輸卵管造影示：雙側(cè)輸卵管通而不暢、上舉，右側(cè)輸卵管增粗，左側(cè)輸卵管呈串珠樣改變。試孕多周期未孕。男方精子濃度、活率、活力均正常，精子正常形態(tài)6%，要求IVF-ET助孕。

第一周期采用超長方案促排卵，月經(jīng)第2天注射醋酸亮丙瑞林(貝依，珠海麗珠)3.75 mg，達到本中心降調(diào)標準后每日注射重組人促卵泡素(果納芬，Serono，瑞士)150 U，促排11 d，當卵泡發(fā)育達到至少有1個主導卵泡直徑≥18 mm或兩個主導卵泡直徑≥17 mm或3個主導卵泡直徑≥16 mm時，于當晚9時注射重組絨促性素(艾澤，默克雪蘭諾，英國)250 μg，注射后36～38 h經(jīng)陰道超聲引導下取卵，2015年9月共獲卵23枚。授精6 h觀察，成熟卵均未見2個極體(2PB)；21枚卵行補救卵胞漿內(nèi)單精子注射(R-ICSI)授精，2枚卵行常規(guī)IVF授精；授精后18 h(D1)觀察，R-ICSI中9枚核碎裂，IVF中1枚核碎裂，均未見2個原核(2PN)；授精后44 h(D2)和68 h(D3)觀察均未卵裂，無可移植胚胎。

第二周期采用拮抗劑方案，注射用尿促性素(HMG，珠海麗珠)150 U促排啟動，適時添加GnRH拮抗劑注射用醋酸西曲瑞克(思則凱，雪蘭諾，瑞士)0.25 mg，促排10 d后，予GnRH激動劑(GnRH-a，達必佳，輝凌，瑞士)0.2 mg聯(lián)合人絨毛促性腺激素(HCG，珠海麗珠)2 000 U雙扳機，注射后36～38 h經(jīng)陰道超聲引導下取卵，2016年3月共獲卵19枚，MⅡ卵16枚，行ICSI后D1觀察，僅1枚2PN；D3觀察胚胎為5細胞Ⅱ級胚胎，移植后未妊娠。

第三周期采用超長方案，注射用尿促性素(HMG，珠海麗珠)150 U啟動，促排16 d，艾澤250 μg聯(lián)合HCG 2 000 U扳機，2016年12月取卵共獲卵12枚。由于不明原因不受精(核碎裂)和低受精，經(jīng)臨床醫(yī)生與實驗室胚胎專家討論擬定方案：6枚卵冷凍，6枚卵行ICSI并輔助激活。6枚卵中MⅡ卵5枚、MⅠ卵1枚，5枚卵行ICSI，30 min后行激活劑A23187(濃度5 μmol/L)激活10 min；D1觀察未受精，患者本周期未移植。

2020年7月29日患者再次來院治療，為了查明不受精原因，詳細詢問患者夫婦病史，自述雙方父母及兄妹均無異常生育史。取患者夫婦外周血送檢，全外顯子檢查，女方TUBB8、WEE2基因外顯子編碼區(qū)測序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)致病突變位點；男方基因PLCZ1、DNAH1、MEIOB外顯子測序發(fā)現(xiàn)基因變異：PLCZ1復合雜合突變、MEIOB基因突變，具體臨床意義不明(表1，圖1)。

表1 男方外顯子檢測PLCZ1、MEIOB突變位點

圖1 PLCZ1基因突變定位

2021年3月27日行卵子解凍周期移植，解凍卵子6枚，全部存活，解凍后行ICSI受精，ICSI后30 min采用A23187(濃度10 μmol/L)對卵母細胞行輔助激活10 min。D1觀察2PN受精6枚；D3移植8細胞Ⅱ級胚胎2枚，冷凍1枚4BB囊胚。移植后14 d查血β-HCG 109 U/L，移植后28 d行B超檢查未見孕囊，為生化妊娠。

之后行人工周期凍融胚胎移植(FET)，按照本中心內(nèi)膜準備標準準備內(nèi)膜[1]，內(nèi)膜厚度8.5 mm、分型為A型時解凍1枚4BB囊胚，囊胚解凍4 h未擴張，移植后未妊娠。

第四周期采用拮抗劑方案，注射用尿促性素(HMG，珠海麗珠)262.5 U啟動，促排9 d，艾澤250 μg聯(lián)合HCG 2 000 U扳機，2021年8月6日取卵共獲卵12枚，其中MⅡ卵11枚，MⅠ卵1枚，行ICSI授精，30 min后使用激活劑A23187(濃度10 μmol/L)激活10 min，受精10枚；D3移植8細胞Ⅱ級胚胎和10細胞Ⅱ級胚胎各1枚；D5冷凍兩枚囊胚(4AB、4BB)。移植后14 d查血HCG未妊娠。9月30日再次行人工周期FET，內(nèi)膜厚度9 mm、分型A型時移植1枚4AB囊胚，移植后16 d查血β-HCG 5 200 U/L，移植28 d行B超檢查可見孕囊及心管搏動，確定為臨床妊娠。至此文撰稿時患者孕期平穩(wěn)，規(guī)律產(chǎn)檢，無特殊。

二、討論

人類卵子在受精過程中與精子通過一系列復雜的相互作用被激活，從而啟動胚胎發(fā)育。臨床上經(jīng)常會遇到受精失敗的現(xiàn)象，可以通過短時受精早期觀察聯(lián)合R-ICSI的方式挽救，在下個周期采取ICSI授精，但仍有1%～4%的患者會發(fā)生受精失敗[2]。受精失敗的原因分為卵子因素和精子因素。精子因素主要是特異性卵母細胞激活因子(sperm-borne oocyte activation factor，SOAF)缺乏導致卵母細胞激活失敗[3]，如比較明確的圓頭精子癥。而對于精液常規(guī)參數(shù)正常的患者，往往難以明確。PLCZ1(phospholipase C zeta 1)是一種精子特異性蛋白，是激活卵母細胞的主要因子。如果其發(fā)生突變或缺乏就會影響卵母細胞激活，導致受精失敗[4]。本文患者的配偶存在PLCZ1復合雜合突變伴MEIOB突變，其中PLCZ1存在一個新突變位點，目前國內(nèi)外尚未報道。我中心通過ICSI聯(lián)合卵母細胞輔助激活技術(shù)(assisted oocyte activation，AOA)使其獲得臨床妊娠。本文回顧性分析了該患者的診療經(jīng)過以及如何發(fā)現(xiàn)男方PLCZ1基因突變導致的受精障礙，并進行文獻復習，旨在更好的為臨床工作提供參考。

在人卵母細胞的發(fā)育過程中，經(jīng)歷了兩個較長時間的停滯。第1次在胚胎期或出生初期，卵母細胞發(fā)育至第1次減數(shù)分裂前期停滯，在促性腺激素FSH及LH的作用下，優(yōu)勢發(fā)育的卵母細胞解除阻滯，恢復減數(shù)分裂并排出第一極體，形成次級卵母細胞后，再一次停滯在第2次減數(shù)分裂中期等待受精。兩次阻滯解除均需要特殊的分子作用，第1次在促性腺激素LH的作用下，激活cAMP-PKC、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)等通路，卵母細胞恢復減數(shù)分裂[5]。第2次是精子的受精作用，由精子釋放SOAF激活卵母細胞內(nèi)Ca2+信號通道，引發(fā)鈣震蕩，卵母細胞被激活[6]。有關(guān)SOAF的候選精子蛋白一直存在爭議，目前PLCZ1被認為是最主要的作用蛋白[7]，該基因突變導致受精失敗的案例曾有報道[8-9]。PLCZ1主要定位于精子頭部頂體內(nèi)膜和核膜之間的核周鞘[10-11]。精卵質(zhì)膜融合后，PLCZ1進入卵母細胞，作用于磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3)，IP3可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放，持續(xù)性的Ca2+濃度波動誘發(fā)卵母細胞阻滯解除并啟動胚胎發(fā)育[7，12]。有研究顯示存在PLCZ1基因突變的精子常表現(xiàn)出卵母細胞激活障礙[8]。

在本病例中，男方精子DNA碎片指數(shù)(DFI)及各項參數(shù)均正常，患者夫婦的父母兄妹均無生育異常史。R-ICSI周期有部分卵核碎裂現(xiàn)象，未見2PN卵、未卵裂，最終無可移植胚胎；第二周期ICSI受精僅1枚，移植后未孕；第三周期由于未排除卵源性因素所致受精障礙，行部分卵母細胞ICSI+AOA，受精失敗，未移植。除外ICSI操作技術(shù)的原因，高度懷疑患者夫婦存在基因缺陷，為查明原因?qū)υ搶Ψ驄D抽血進行了全外顯基因檢測，結(jié)果顯示丈夫的PLCZ1是一個雙等位基因的復合雜合突變，第1個突變位點在c.588C>A(p.C196X)，ExAC數(shù)據(jù)庫顯示該突變在東亞人群中頻率為0.000 2。第2個突變位點在c.1589dupA(p.N530Kfs*3)，該突變是新突變，未曾在ExAC數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，目前國內(nèi)外未見報道。這兩個突變都會導致PLCZ1蛋白翻譯提前終止而喪失功能。妻子的檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與受精相關(guān)的致病變異點。PLCZ1基因的變異類型以點突變?yōu)橹鳎Ｒ姷狞c突變?nèi)绫緢蟾嬷械腸.C588A，這是一種無義突變，編碼氨基酸的密碼子突變成終止密碼子，蛋白的翻譯提前終止形成一條喪失活性的多肽鏈[13]。此外錯義突變[9]、缺失[14]、重復等多種突變類型也均有報道。

近幾年關(guān)于PLCZ1突變的病例不斷被報道，2012年kashir等[15]對患病家族行遺傳學分析表明PLCZ1具有常染色體隱性遺傳模式，首例PLCZ1復合雜合突變病例被報道，突變分別遺傳自患者的父親和母親。Yuan等[9]研究了5個PLCZ1突變的患病家庭，在雙等位突變的患者精液中分析PLCZ1蛋白均未見表達，家族中攜帶雜合突變的成員則可以檢測到陽性條帶；隨后對女方采取鈣離子載體的AOA，4對夫婦獲得優(yōu)質(zhì)胚胎?；赑LCZ1蛋白在卵母細胞激活作用中的研究，Rogers等[16]首次在人卵母細胞上使用重組PLCZ1 RNA，成功引起了長時間Ca2+的反復震蕩。2017年，Yamaguchi等[17]在對人卵母細胞注射重組PLCZ1 RNA的同時與傳統(tǒng)的AOA方法(機械激活、電激活和化學激活)進行對比，發(fā)現(xiàn)重組PLCZ1 RNA注射后引發(fā)的Ca2+振蕩幅度、持續(xù)時間、時間累積與ICSI后具有相似的特征。這表明重組PLCZ1 RNA作為一種人工激活劑有望成為一種更接近生理水平的激活劑。但由于人的敏感性不同，很難控制其表達水平來誘導合適的Ca2+振蕩，這種方法存在一定的臨床安全性問題[6]。目前文獻報道的成功案例所采用的AOA方案均為化學激活法，Mu等[18]采用離子霉素激活使兩對夫婦成功妊娠并分娩。Dai等[19]采用鈣離子載體A23187激活，3對夫婦均成功受精并獲得胚胎。但AOA的作用并非絕對，Wang等[11]的報告中患者的卵母細胞在AOA后受精持續(xù)偏低，顯示胚胎發(fā)育不良。因此，對PLCZ1缺陷患者AOA的臨床應用仍需要胚胎學家進一步探索和研究。

根據(jù)目前的文獻報道及本例患者既往的輔助生殖治療方案，第三周期6枚卵子中MⅡ卵5枚、MⅠ卵1枚，對5枚卵母細胞行ICSI及激活劑A23187(濃度5 μmol/L)激活，未受精。在隨后的解凍卵子移植周期中，仍使用A23187的Ca2+載體化學激活方案，同時加大激活劑的使用濃度(10 μmol/L)對卵母細胞行輔助激活，ICSI后30 min作用時間10 min。共解凍6枚卵子，存活6枚，正常受精6枚，于D3移植2枚8細胞Ⅱ級胚胎，冷凍1枚4BB囊胚，結(jié)果生化妊娠。在解凍卵子周期及第四周期中均獲得了較好的受精率及優(yōu)胚率，并最終獲得臨床妊娠。故在以后卵母細胞激活時，尤其是明確具有與受精障礙有關(guān)基因突變的患者，建議使用激活劑A23187或離子霉素激活濃度10 μmol/L，以獲得較好的受精率、優(yōu)胚率及妊娠結(jié)局。另外，患者曾3次D3移植，2次失敗1次生化妊娠，對于反復種植失敗患者應考慮囊胚移植。

結(jié)合目前的臨床資料報告[20-21]，ICSI+AOA的方法對于受精失敗的患者是顯著有效的，可以改善臨床結(jié)局。隨著AOA的使用增多，針對AOA風險的爭論也逐漸增加。一項長達6年的跟蹤研究項目顯示，應用AOA技術(shù)出生的嬰兒與常規(guī)ICSI出生的嬰兒相比，在3～10歲成長過程中并無顯著差異[22]。但也有學者指出在AOA的過程中，培養(yǎng)基中Ca2+載體的暴露會增加表觀遺傳缺陷風險[23]。因此為了避免過度使用AOA，應對受精失敗的患者建立客觀評價體系，以確立統(tǒng)一的AOA使用標準[24-25]。

綜上，對于精子PLCZ1基因缺陷患者，采用ICSI+AOA的治療策略可以獲得較好的受精率、優(yōu)胚率和妊娠結(jié)局。目前研究未發(fā)現(xiàn)ICSI+AOA會導致子代出生缺陷風險增加[26-27]。在臨床工作中對于多次受精失敗的患者，尤其男方精液參數(shù)正常者建議采取診斷性檢測，以明確卵子因素或精子因素導致的受精失敗。如果發(fā)現(xiàn)精子PLCZ1基因缺陷者，及時采取ICSI+AOA方案，可以避免再次受精失敗對患者造成不必要的經(jīng)濟損失及身心傷害。同時在臨床工作中對于AOA的使用仍需謹慎，嚴格注意AOA的適應證。應不斷累積相關(guān)的臨床治療數(shù)據(jù)，幫助患者尋求更為安全有效的輔助生殖治療策略。

致謝 感謝復旦大學王磊教授團隊在樣本檢測方面給予的大力支持和幫助！