不同灰樹花多糖提取及其體外抗氧化活性研究

肖建勇，陳智超，朱育嫻，陳可文,3，黃梓芮,2，劉斌,2*

1. 福建農林大學食品科學學院（福州 350002）；2. 福建農林大學國家菌草工程技術研究中心（福州 350002）；3. 西南民族大學食品科學與技術學院（成都 610041）

灰樹花（Grifola frondose）是一種食藥兩用菌，又被稱之為“千佛菌”，其在世界范圍內分布廣泛，在日本、俄羅斯及中國的浙江、福建、四川等地均有種植，在日本還享有“舞茸”的稱號[1-2]。灰樹花不僅風味獨特、口感豐富，而且富含如多糖、多肽、多酚及黃酮等生物活性物質，其獨特的藥用與營養價值使其成為近年來的研究熱點。灰樹花有效成分的研究主要集中于多糖，灰樹花多糖具有抗氧化[3]、免疫調節、抗腫瘤[4]、抗乙型肝炎病毒等生物活性，此外越來越多的研究開始關注其在預防和治療糖尿病、高血糖等疾病方面的潛力。

然而，市面上的灰樹花品類豐富，特征差異極大，有的灰樹花分支長，葉片大，顏色灰白，而有的則菇型緊湊，分支適中，顏色呈灰褐色，大朵灰樹花的單朵質量遠超于小朵灰樹花。很多灰樹花工藝研究以及營養學分析都未提及所用灰樹花的具體品類，這對灰樹花的后續研究有著較大的阻礙。最早開始研究灰樹花栽培技術的國家是日本，經過多年的探索不僅保證產量逐年上升，而且實現周年化栽培。我國浙江省慶元縣和河北遷西縣在20世紀80年代開始野生灰樹花人工馴化栽培和菌棒式栽培，開創仿野生栽培方式、二次覆土栽培和二次無土栽培模式，在灰樹花栽培方面技術相對成熟[5]。然而優良菌株是推動灰樹花產業發展的重要動力，福建南平響應國家科技扶貧相關政策，近年來也開始對灰樹花進行選育工作，雖然起步相對較晚，但部分地區已開展規模化栽培。試驗通過與慶元的灰樹花品種相比較來培育和推廣生物活性物質含量更高的新品種以促進福建省灰樹花的開發利用。同時，灰樹花作為一種中溫型、喜光的木質腐生菌，其生長受環境因素影響較大，環境溫度、水分濕度及光照情況等都會影響其子實體的發育[6]。不同地區的氣候等條件有所差別，產自不同地區的灰樹花也具有不同的形態學方面的特征，但其營養價值以及生物活性物質含量等方面是否具有顯著性差別則需要通過試驗驗證。因此，試驗針對產自浙江慶元以及福建南平的4種灰樹花的主要成分多糖進行提取，并對獲得的多糖的體外抗氧化活性進行進一步對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花（D1，福建南平大朵；D2，浙江慶元大朵；X1，福建南平小朵；X2，浙江慶元小朵；經福建農林大學菌草工程技術研究中心鑒定，烘干粉碎后備用）；普通型透析袋（3 500 Da，MD3525）、3, 5-二硝基水楊酸（DNS，R23236）、 DPPH（S30629）、2, 2’-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS，S19198），均為上海源葉生物科技有限公司；BCA試劑盒（P0010BCA，上海碧云天生物技術有限公司）；10×PBS緩沖液（E607016，上海生工生物股份有限公司）；過硫酸鉀、FeSO4、H2O2、水楊酸、葡萄糖、無水乙醇、丙酮、無水乙醚等化學試劑（均為國藥分析純）。

1.2 灰樹花多糖的制備

精確稱取20 g經烘干粉碎的灰樹花粉末，加入其10倍體積的95%乙醇，在45 ℃恒溫水浴條件下按45 kHz超聲處理1 h，經六層紗布過濾后按4 000 r/min離心15 min，濾渣烘干后加入25倍體積的去離子水，超聲1 h（45 ℃，45 kHz），于100 ℃水浴1 h，離心，將上清液經減壓濃縮后加入4倍體積乙醇于4 ℃醇沉12 h，按4 000 r/min離心15 min獲得沉淀即為粗多糖。依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，于40 ℃烘干乙醚，用Sevag法（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）除去蛋白，并用3 500 Da的透析袋透析48 h，減壓濃縮后凍干，即制得灰樹花多糖。

1.3 試驗方法

1.3.1 灰樹花多糖理化性質測定

1.3.1.1 總糖含量測定

灰樹花總糖含量的測定參考苯酚-硫酸法[7]。繪制標準曲線：配制質量濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的葡萄糖標準體系；各取500 μL至裝有500 μL 5%苯酚的試管中，充分搖勻后加入2.5 mL濃硫酸，沸水浴15 min后放置20 min冷卻，每管中移取200 μL至96孔板，測定樣品吸光度（490 nm）。繪制標準曲線并計算得回歸方程y=3.836 8x+0.261 2（R2=0.990 8）。

灰樹花多糖溶液吸光度的測定：配制質量濃度1 mg/mL的灰樹花多糖溶液，重復上述步驟測定吸光度。

1.3.1.2 還原糖含量測定

還原糖含量的測定參考DNS法[8]。繪制標準曲線：參照1.3.1.1小節配制葡萄糖標準體系；各取100 μL至裝有100 μL DNS試劑的試管中，充分搖勻后水浴5 min；流水冷卻后用蒸餾水定容至1 mL；移取200 μL至96孔板，測定在540 nm波長下的吸光度。繪制標準曲線并計算得回歸方程y=0.655 7x-0.015 8（R2=0.990 8）。

灰樹花多糖溶液吸光度的測定：配制質量濃度2 mg/mL的灰樹花多糖溶液，重復上述步驟測定吸光度。

1.3.1.3 蛋白含量的測定

測定灰樹花蛋白質含量參考BCA法[9]，并稍加修改。繪制標準曲線：參照1.3.1.1小節配制牛血清白蛋白（BSA）標準體系；各取0.1 mL至裝有2 mL工作液（VA液∶VB液=50∶1）的試管中，充分搖勻后于37 ℃孵育30 min；移取200 μL至96孔板，測定在562 nm波長下的吸光度。繪制標準曲線并計算得回歸方程y=0.562 7x-0.014 3（R2=0.991 6）。

灰樹花多糖溶液吸光度的測定：配制質量濃度2 mg/mL的灰樹花多糖溶液，重復上述步驟測定吸光度。

1.3.2 抗氧化性測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除率的測定。

DPPH自由基清除方法已經在比較姬松茸胞外多糖抗氧化能力中得到應用[10]。將灰樹花多糖以及VC配制成質量濃度分別為0.125，0.250，0.500，1.000和2.000 mg/mL的溶液體系；各取100 μL加入至裝有100 μL濃度為0.2 mmol/L DPPH的1.5 mL離心管中，其中抗壞血酸（VC）溶液為陽性對照組；充分混勻后在避光條件下保存，反應30 min，離心后取上清液；測定樣品吸光度（517 nm），并根據式（1）計算。

式中：A樣品為灰樹花溶液體系反應后的吸光度；A對照為用無水乙醇取代DPPH反應后的背景吸光度；A空白為用無水乙醇取代灰樹花多糖與DPPH反應的陰性對照吸光度。

1.3.2.2 ABTS自由基清除率的測定。

參照吳娟等[11]的ABTS清除試驗。制備ABTS自由基溶液：將5 mL過硫酸鉀（2.45 mmol/L）與5 mL ABTS（7 mmol/L）混合后在室溫條件下避光保存16 h，測定前用PBS（濃度50 mmol/L，pH 7.4）稀釋至其在734 nm處吸光度為0.70±0.02；參照1.3.2.1小節配制灰樹花多糖及VC溶液體系；各取50 μL至酶標板，其中抗壞血酸（VC）溶液為陽性對照組；保溫3 min（30℃）后迅速加入150 μL ABTS自由基溶液，搖勻后繼續保溫，反應6 min；測定樣品吸光度（734 nm），并根據式（2）計算。

式中：A樣品為灰樹花溶液體系反應后的吸光度；A對照為50 μL樣品加入150 μL PBS的背景吸光度；A空白為用PBS取代灰樹花多糖的陰性對照吸光度。

1.3.2.3 羥自由基清除率的測定。

參考羥自由基清除法[12]。參照1.3.2.1小節配制灰樹花多糖及VC溶液體系，體積均為1 mL，其中VC溶液為陽性對照組；依次加入0.5 mL FeSO4、0.35 mL H2O2后混勻并在37 ℃條件下孵育10 min；加入0.15 mL水楊酸（20 mmol/L）混勻并在37 ℃條件下反應30 min；測定樣品吸光度（562 nm），并根據式（3）計算。

式中：A樣品為灰樹花溶液體系反應后的吸光度；A對照為用去離子水取代水楊酸后的背景吸光度；A空白為用去離子水取代灰樹花多糖的陰性對照吸光度。

1.4 數據分析

試驗中涉及吸光度的測定均采用4組平行試驗并求取平均值。采用Excel軟件對數據進行統計分析、繪制標準曲線并計算回歸方程，采用SPSS 26進行顯著性分析，采用GraphPad Prism 8軟件進行IC50的計算。

2 結果與分析

2.1 灰樹花多糖得率

根據前期試驗確定提取方案，精確稱取4種灰樹花粉末，各20 g，最終計算得到得率，如表1所示。D1多糖5.43%，D2多糖3.93%，X1多糖5.71%，X2多糖4.79%。提取得率按式（4）計算。

表1 灰樹花多糖得率及理化性質 單位：%

提取得率=所得多糖質量（g）/灰樹花粉末質量（g）×100% （4）

2.2 灰樹花多糖理化性質

根據灰樹花多糖樣品吸光度及回歸方程，計算得4種灰樹花多糖各自的還原糖含量、總糖含量和蛋白含量。從表1可以看出，不同種類灰樹花還原糖含量差異較小，說明透析的效果基本相同，小分子量的低聚糖或者單糖已被除去，后續可用過柱純化或者其他方式進一步得到精多糖。特別地，4種多糖的總糖含量差異較大，含量最高的為D1，其總糖含量達到72.88%，但是D2和X2灰樹花多糖的總糖含量較低，都不足50%，有可能是苯酚硫酸法的局限性，多糖中包含的不同的單糖在苯酚硫酸法反應后顯色程度不一，張美等[13]關于三七多糖含量的測定試驗表明除還原糖種類外，加熱時間、溫度、苯酚用量等因素同樣會影響體系吸光度，也有可能是其本身有較多的其他雜質不易除去，這在粗多糖的提取研究中較為常見。此外，在D1多糖中未檢測到蛋白含量，說明D1灰樹花本身的多糖含量較高且蛋白質含量低，這與灰樹花品種以及生長地區氣候條件息息相關，所以D1灰樹花適合得到較高產率及純度的灰樹花多糖。此外，雖然已用Sevag法反復多次純化其他多糖，但是仍有蛋白質的殘留，這說明通過Sevag法洗脫蛋白仍有改進的空間，或是因為不同品種灰樹花所含蛋白分子量差異較大，3 500 Da的透析袋對于其他3種灰樹花無法徹底除去蛋白，這有待進一步試驗驗證。但是，相關試驗表明Sevag法是除了三氯乙酸法以外蛋白清除率較高并且多糖損失較少的方法[14]。

2.3 灰樹花多糖抗氧化指標綜合分析

由圖1可知，與其他3種多糖相比，D1多糖的自由基清除能力明顯較弱。4種灰樹花多糖對DPPH自由基的IC50分別為1.460±0.070（D1），0.500±0.050（D2），0.390±0.010（X1）和0.620±0.060 mg/mL（X2）。結果表明，4種灰樹花多糖均具有較好的DPPH自由基清除能力，相比之下D1多糖自由基清除能力弱于其他3種灰樹花多糖，4種多糖DPPH自由基清除能力從強到弱排序為X1、D2、X2和D1。

圖1 灰樹花多糖對DPPH自由基清除作用

由圖2可知，質量濃度0.5 mg/mL時X2多糖的自由基清除率與作為陽性對照的VC相接近，其余3種多糖的清除率分別為51.89%（D2），71.62%（X1）和93.08%（D1）。在質量濃度從0.5～2 mg/mL的范圍內，自由基清除率隨濃度增加而增強的趨勢減緩。結果顯示，灰樹花多糖的IC50分別為0.430±0.010（D1），0.170±0.010（D2），0.270±0.007（X1）和0.160±0.004 mg/mL（X2），因此4種多糖ABTS自由基清除能力從強到弱排序為X2、D2、X1和D1。

圖2 灰樹花多糖對ABTS自由基清除作用

由圖3可知，質量濃度2 mg/mL時，羥自由基清除率由高到低分別為70.43%（D2），68.90%（X1）、63.06%（X2）和43.57%（D1）。這說明不同灰樹花多糖也具有一定的羥基自由基清除能力。進一步計算其IC50，結果分別為2.810±0.569（D1），0.650±0.051（D2），1.070±0.025（X1）和1.420±0.282 mg/mL（X2），因此多糖抗氧化能力從強到弱排序為D2、X1、X2和D1。這與DPPH自由基清除能力的結果相似，X1和D2和抗氧化能力較高，D1則最低。

圖3 灰樹花多糖對羥基自由基清除作用

由圖4可知，參與試驗的4種灰樹花多糖在3種自由基清除指標下的IC50值均較小，因此具有較強的抗氧化能力。DPPH自由基清除能力最強的是X1，其IC50為0.390±0.010 mg/mL；X2多糖對ABTS自由基有最佳的抑制能力，IC50為0.160±0.004 mg/mL；D2多糖對羥自由基抑制能力的IC50為0.650±0.051 mg/mL，是同組中抑制率最高的。由圖4可以直觀地看出：當采用DPPH和OH-為指標時，D2與X1多糖的IC50小于同組的D1與X2多糖；僅當采用ABTS為指標時，X2多糖效果會優于X1多糖，但與D2多糖相比無顯著性差異。因此綜合3種抗氧化指標，D2及X1灰樹花多糖的抗氧化能力最為理想。關于灰樹花多糖結構與其生物活性間關聯的研究較少，張宗啟等[15]對其研究現狀進行總結得出，多糖生物活性與其聚合度、分子量、糖苷鍵類型、支鏈數等因素有關，以一種叫作FGFP-11的灰樹花雜多糖為例，它主要由α-（1→6）糖苷鍵和α-（1→3）糖苷鍵構成，并被認為具有較強的抗氧化性；除此之外，灰樹花多糖的分子量、分子結構、生物活性也受品種、處理手段等多種因素的影響。結合表2與圖4可以看出，D1灰樹花多糖的總糖含量最高，但經過脫蛋白后未檢測出蛋白含量，而其余3種多糖中均有檢測出。有研究表明灰樹花多糖提取副產物中蛋白也具有抗氧化性[16]。因此，D1多糖抗氧化活性最低，除了可能與本身分子結構有關以外，還可能是因為完全脫除具有一定抗氧化性能的蛋白。

圖4 灰樹花多糖不同抗氧化指標下的IC50

3 結論

主要從多糖提取率、抗氧化性這2個方面對D1，D2，X1和X2這4種不同產地和品種的灰樹花進行比較。經過水提醇沉、Sevag除蛋白、透析等操作獲得灰樹花多糖。其中，福建南平大朵灰樹花（D1）不僅提取率較高，還具有總糖含量高、蛋白洗脫效果好的特點，作為原料對進一步的多糖純化制備有著天然優勢。在抗氧化性方面，浙江慶元大朵（D2）與福建南平小朵（X1）的多糖對DPPH、ABTS及羥基自由基的清除能力均較為優秀，具有被開發成安全性高的天然抗氧化劑的潛力。因此，福建南平出產的2種灰樹花在多糖含量以及抗氧化活性方面各具優勢。為最大程度地開發利用灰樹花資源，在進一步試驗中需要對福建南平出產的灰樹花進行品種鑒定以及系統學命名。此外，還需要對其灰樹花多糖進行色譜純化以獲取精多糖，并針對精多糖進一步進行生物活性評價。