羅漢參皮總黃酮的提取工藝優化及其抗氧化活性研究

宋代榮，劉昌衡,2，賈愛榮,2，白義化，苗佳琳，張綿松,2*

1. 齊魯工業大學（山東省科學院），山東省科學院生物研究所（濟南 250103）；2. 中澳特色生物資源產業技術創新聯合實驗室（濟南 250103）；3. 威海市宇王集團有限公司（威海 264500）

羅漢參（Apios americanaMedic.），又稱美洲土欒（圞）兒、土欒（圞）兒、菜用土欒（圞）兒等，豆科土欒兒屬，為多年蔓生草本植物，塊根呈圓球形或不規則長圓形，長3～8 cm，表皮呈土黃色，上有斷續的環狀紋理，肉質潔白細嫩[1]。羅漢參主產于我國山東單縣，由于其富含抗性淀粉[2]和膳食纖維，且營養豐富，同時含有多種氨基酸[3]及微量元素[4]，在民間長期作為一種保健食品食用。

由于羅漢參為地方中草藥，對其進行的研究并不多。《全國中草藥匯編》中記載土欒（圞）兒塊根的主要成分是“淀粉”。對其化學成分的研究結果表明羅漢參中含有生物堿類成分。藥效學試驗表明，羅漢參總生物堿對人肺腺癌A549細胞、人肝癌HepG2細胞、人胰腺癌BxPC-3細胞、人惡性淋巴瘤Raji細胞有較好的抑制作用，因此，羅漢參可被稱之為一種非常具有養生意義的功能性保健食材[5]。

羅漢參皮是食用和加工后的廢棄物，其中含有多酚、黃酮、皂苷類化合物等。其中的總黃酮是一類在自然界廣泛存在的多酚類物質，具有清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗突變、抗病毒和調節免疫等作用[6]。其作為一種廣泛應用的抗氧化功能因子，應當被更有效地開發利用。總黃酮的提取方式主要包括水提法、微波法[7]、超濾法[8]和超聲輔助提取法，其中超聲輔助提取法具有提取率高、耗時少、提取物結構不易被破壞等優點，被廣泛運用于黃酮類化合物的提取[9-11]。因此，試驗對羅漢參皮總黃酮的超聲輔助提取方法進行工藝優化，并進行抗氧化活性研究，旨在為羅漢參皮總黃酮的提取及其在抗氧化產品中應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

羅漢參（菏澤單縣天祥羅漢參專業合作社）。將剝下的新鮮羅漢參皮在50 ℃下烘干，磨粉后過0.180 mm（80目）篩，放入干燥器備用。

1.1.2 試劑

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH；Sigma-Aldrich，Germany）；Griess reagent（Sigma-Aldrich，Germany）；2, 2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS；Sigma-Aldrich，Germany）；蘆丁標準品（CAS153-18-4，麥克林）；其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

Centrifuge 580412型離心機（Germany）；EX124ZH/AD型電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；SCIENTZ-950E超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；M200pro型酶標儀（瑞士TECAN）。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗設計

分別稱取0.500 g羅漢參皮粉末，置于5個EP管中，分別加入一定量的乙醇溶液，在一定的溫度下超聲提取一定時間后，取出EP管，在6 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液測定總黃酮含量。依次考察乙醇體積分數、提取時間、料液比、超聲功率和提取溫度對總黃酮得率的影響。單因素基礎試驗條件：乙醇溶液體積分數70%、提取時間6 min、料液比1∶10（g/mL）、超聲功率60 W、提取溫度40 ℃。各因素取值范圍：乙醇體積分數50%，60%，70%，80%，90%和100%；提取時間3，6，9和12 min；料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL）；超聲功率30，60，90和120 W；提取溫度10，25，40，55和70 ℃。

1.2.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理[12-15]，以乙醇體積分數（X1）、超聲波功率（X2）和料液比（X3）為自變量，以總黃酮得率為響應值，設計三因素三水平試驗。響應面試驗設計因素水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平表

1.2.3 統計分析

試驗重復3次，結果取平均值，采用Design Expert軟件對數據進行響應面分析，包括顯著性差異、方差分析、最佳試驗條件和最佳響應值預測。

1.2.4 總黃酮含量的測定

1.2.4.1 蘆丁標準曲線的制作

參考Moreno等[16]的方法，準確稱取10 mg蘆丁標準品，用70%乙醇溶解并定容至100 mL，得到質量濃度100 μg/mL的蘆丁標準溶液。依次將溶液稀釋到20，40，60，80和100 μg/mL，取120 μL不同濃度稀釋的蘆丁標準品溶液，加水稀釋至960 mL，分別向其中加入64 μL質量濃度50 mg/mL的亞硝酸鈉溶液，混合均勻，室溫孵育6 min后，加入64 μL的AlCl3溶液（100 mg/mL），混合均勻，室溫孵育5 min后，加入800 μL的NaOH溶液（40 mg/mL），混合均勻，避光，室溫孵育30 min，用酶標儀在410 nm波長下進行檢測。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作蘆丁標準曲線，所得的標準曲線方程為y=0.004 9x+0.057 1（R2=0.999 1）。

1.2.4.2 羅漢參皮總黃酮得率計算

離心后的提取液按標準曲線相同操作測定羅漢參皮總黃酮的吸光度，利用標準曲線方程計算出提取液中總黃酮濃度，并按式（1）計算羅漢參皮總黃酮得率（mg/g）。

1.2.5 DPPH清除率的測定[17]

取0.1 mL樣品液，加入0.9 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（99%乙醇溶解），漩渦振蕩混勻10 s后，置于暗室反應30 min。在517 nm處測各樣品的吸光度。對照組取乙醇代替樣品液。得出的數據按式（2）計算處理，得到DPPH清除率。

1.2.6 ABTS自由基清除活性測定

ABTS自由基的測定參照Ala?ón等[18]方法。將ABTS母液（7 mmol/L）和過硫酸鉀溶液（2.4 mmol/L）等體積混合，室溫放置12～16 h。用乙醇稀釋至吸光度穩定在0.7±0.02（稀釋比例約1∶48）為止，即制成ABTS工作液，將稀釋到適當濃度的樣品溶液加到96孔板中，加入200 μL新鮮配制的ABTS工作液，室溫條件下避光孵育5 min。用酶標儀在734 nm波長下檢測吸光度。自由基清除率按式（3）計算。

式中：AS為樣品溶液吸光度；A0為空白溶液吸光度。

1.2.7 還原力的測定

還原力測定方法參照Arabshahi-Delouee等[19]的方法。準確量取0.4 mL樣品液（0.05～0.20 mg/mL）或空白溶液（蒸餾水），加入1 mL磷酸緩沖液（0.2 mol，pH 6.6）及1 mL 1%鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]）溶液，混合均勻后，于50 ℃水浴孵育20 min；加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液，室溫孵育10 min。取1 mL上述溶液，加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%氯化鐵溶液，均勻混合，用分光光度計在700 nm處測定吸光度。

1.2.8 總抗氧化能力的測定

將0.1 mL樣品（0.2～1.0 mg/mL）的等分試樣與1 mL磷鉬試劑一起加入試管中。試管在90 ℃孵育90 min。讓每個樣品在室溫下冷卻，在695 nm處讀取吸光度。對照溶液由1 mL試劑溶液和0.1 mL蒸餾水組成。吸光度越大則表明總的抗氧化能力越強。

1.3 數據分析方法

試驗各組數據均以“均值±標準差”表示，應用SPSS 20.2軟件處理各組數據，采用One Way ANOVA法分析各組試驗數據之間的差異顯著關系。若計量資料的方差齊，采用單因素方差分析LSD檢驗進行組間比較。若計量資料的方差不齊，采用單因素方差分析Dunnett T3檢驗。其中，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。響應面試驗中采用Design Expert 8.0軟件制圖。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

如圖1所示，乙醇體積分數在50%～90%時，總黃酮得率隨乙醇體積分數升高而增大，乙醇體積分數90%時達到最高值，為7.93±0.48 mg/g。隨著乙醇體積分數繼續升高，總黃酮得率沒有顯著變化，所以最佳乙醇體積分數為90%。

圖1 乙醇體積分數對羅漢參皮總黃酮得率的影響

2.1.2 提取時間對總黃酮得率的影響

如圖2所示，提取時間6 min時，總黃酮得率與9和12 min的總黃酮得率無顯著差異，所以提取時間設為6 min。

圖2 提取時間對羅漢參皮總黃酮得率的影響

2.1.3 料液比對總黃酮得率的影響

如圖3所示，料液比1∶10～1∶40（g/mL）時，總黃酮得率隨溶劑比例增加而升高，料液比到達1∶40（g/mL）時，總黃酮得率達到最高值10.39±0.20 mg/g，繼續增加溶劑比例并不能提高總黃酮的得率，其原因可能是乙醇溶液與羅漢參皮的邊界層濃度差變小，總黃酮的擴散到達平衡狀態[20]。

圖3 料液比對羅漢參皮黃酮得率的影響

2.1.4 超聲功率對總黃酮得率的影響

超聲波振動可以產生強烈的機械效應、空穴效應及熱效應，促進更高的物質溶出率[21]。超聲功率單因素試驗結果如圖4所示。超聲功率30～90 W時，總黃酮得率隨著功率增加而上升。超聲功率90 W時，得率為10.14±0.05 mg/g，達到最高值。隨著超聲功率繼續升高，總黃酮得率沒有顯著上升，甚至在150 W時略有下降。

圖4 超聲功率對羅漢參皮黃酮得率的影響

2.1.5 提取溫度對總黃酮得率的影響

不同溫度對羅漢參皮總黃酮得率的影響結果如圖5所示。提取溫度10～40 ℃時，得率隨溫度升高而增加，提取溫度40 ℃時得率達到最高值10.62±0.66 mg/g。隨著提取溫度繼續升高，部分熱敏性總黃酮可能被破壞，導致總黃酮得率降低。

圖5 提取溫度對羅漢參皮總黃酮得率的影響

2.2 響應面試驗分析

2.2.1 響應面優化試驗結果

在單因數試驗結果的基礎上，以乙醇體積分數、超聲波功率和提取溫度為因素，以羅漢參皮總黃酮得率為響應值，設計響應曲面試驗，試驗結果見表2，對各因素的方差分析結果見表3。

對表2試驗數據進行回歸擬合分析，得到以總黃酮得率Y為響應值的回歸方程：Y=9.61+0.95X1-0.041X2+0.60X3-0.48X1X2+0.11X1X3+0.10X2X3-2.20-0.35+0.039。

表2 響應面分析方案及試驗結果

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型誤差小。R2值為0.986 5，R2 adj值為0.962 1，C.V.值為0.817 8%，說明模型擬合度良好。方差分析檢驗結果顯示，乙醇體積分數、料液比及乙醇體積分數的平方項對羅漢參皮總黃酮得率均有極顯著影響（P＜0.01），乙醇體積分數和超聲功率對羅漢參皮總黃酮得率影響顯著（P＜0.05）。依據回歸方程系數可知，3個因素對羅漢參皮總黃酮得率影響順序為乙醇體積分數（X1）＞料液比（X3）＞超聲功率（X2）。

表3 方差分析結果

2.2.2 各因素交互作用分析

方差分析檢驗結果顯示，乙醇體積分數的平方項對羅漢參皮總黃酮得率均有極顯著影響（P＜0.01），乙醇體積分數和超聲功率的交互項對羅漢參皮總黃酮得率的影響顯著（P＜0.05）。通過Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制相應的響應面圖，結果如圖6所示。

圖6 各因素交互作用對羅漢參皮總黃酮得率影響的響應面圖

X1X2對羅漢參皮總黃酮得率的影響是一個球形曲面，在各個方向都是先增加后減少的趨勢，響應面的最高點對應的X1和X2的坐標取值即為最優條件。X1X3對響應值影響在不同的方向是不一樣的，是一個鞍型曲面；而X2X3的影響則是一個接近平面的曲面，說明其影響不顯著。

2.2.3 驗證性試驗

根據響應面回歸模型預測可得最佳提取工藝參數：乙醇體積分數95.7%、超聲功率120 W、料液比1∶46（g/mL），此時羅漢參總黃酮得率最高預測值為9.244 mg/g。為方便試驗操作，確定其最終提取工藝條件：乙醇體積分數96%、超聲功率120 W、料液比1∶46（g/mL）。在此最優組合下進行3次平行驗證試驗，羅漢參皮總黃酮得率平均值為9.116 mg/mL，與預測值相近，進一步證明該模型的可信性。

2.3 羅漢參皮總黃酮的抗氧化活性分析

2.3.1 樣品前處理

將提取的羅漢參皮總黃酮進行等梯度稀釋，以等濃度VC作為對照進行抗氧化活性的測定。

2.3.2 DPPH清除率

如圖7所示：羅漢參皮總黃酮和VC清除率都隨著各自質量濃度上升而有所提高，但是羅漢參皮總黃酮對DPPH自由基清除能力明顯低于VC，0.1 mg/mL時羅漢參皮總黃酮清除率不到20%，而VC清除率達80%以上。最終在質量濃度0.6 mg/mL時，羅漢參皮總黃酮清除率可達到60%左右。劉青等[22]對山藥皮中總黃酮的抗氧化性進行研究，提取的山藥皮總黃酮對DPPH清除作用隨提取物濃度增加而增加，而且在質量濃度0.01 mg/mL時，清除率約15%，這與試驗結果相似。王曉琳等[23]在對黃芪莖總黃酮的研究中測得，在質量濃度0.1～0.6 mg/mL時，黃芪莖黃酮對DPPH清除率持續上升，這與試驗結果中清除率的趨勢一致。

圖7 羅漢參皮總黃酮及VC對DPPH·的清除作用

2.3.3 ABTS自由基清除活性

如圖8所示：0.1 mg/mL VC的ABTS自由基清除活性達100%；羅漢參總黃酮在0～0.4 mg/mL質量濃度范圍內，其ABTS自由基清除活性隨質量濃度上升而快速升高。在0.4 mg/mL時清除活性接近100%。張靜等[24]對樺褐孔菌黃酮類化合物的研究中指出，優化提取工藝后得到的黃酮類化合物在質量濃度0～0.8 mg/mL時對ABTS自由基清除效果隨著濃度增大而上升，在0.8～1.0 mg/mL質量濃度時與VC清除率相似。這表明羅漢參皮總黃酮的ABTS自由基清除活性優于樺褐孔菌黃酮類化合物的清除活性。

圖8 羅漢參皮總黃酮及VC對ABTS·的清除作用

2.3.4 還原力測定

如圖9所示：羅漢參皮總黃酮和VC總還原力都隨著濃度上升而升高。在1～0.2 mg/mL濃度區間，VC和羅漢參皮總黃酮的還原力與濃度都呈線性關系，但是VC還原力較大，而且上升較快。在0.2～0.6 mg/mL濃度區間，VC和羅漢參皮總黃酮還原力與濃度也都呈線性關系，而且直線的斜率相近。

圖9 羅漢參皮黃酮及VC總還原力的測定

2.3.5 總抗氧化測定

如圖10所示：羅漢參皮總黃酮和VC的總抗氧化能力均隨著質量濃度上升有顯著提高。質量濃度在0.155 mg/mL時，兩者總抗氧化能力相近，VC總抗氧化能力急劇上升而羅漢參皮總黃酮的總抗氧化能力上升速率相對緩慢。

圖10 羅漢參皮總黃酮及VC總抗氧化的測定

3 結論

試驗利用超聲波輔助提取羅漢參皮中的總黃酮，通過響應面試驗分析得出最佳提取工藝：乙醇體積分數95.7%、超聲功率120 W、料液比1∶46（g/mL）、提取溫度40 ℃、提取時間6 min，在該條件下總黃酮得率為9.116 mg/g。對提取的羅漢參皮總黃酮進行DPPH清除率、ABTS清除活性、還原力和總抗氧化能力4項抗氧化活性分析時發現，羅漢參皮總黃酮在這4項抗氧化活性測試中均表現出濃度依賴性，濃度越高，活性越好。在質量濃度0.6 mg/mL時，羅漢參皮總黃酮的DPPH清除率可達60%左右；在0.4 mg/mL時ABTS清除活性接近100%；在0～0.6 mg/mL質量濃度區間，羅漢參皮總黃酮的還原力與濃度呈線性關系；在0～1 mg/mL質量濃度區間，羅漢參皮總黃酮的總抗氧化能力與濃度也呈線性關系。這些體外量效關系研究為羅漢參皮總黃酮的應用提供參考。