枸杞黃芪復(fù)合多糖多種提取方法的比較

蓋永強(qiáng)，藍(lán)天嬋，張樂宏，鄭卓琦，樸美子，李巖

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（青島 266109）

枸杞屬茄科落葉灌木，主要產(chǎn)于我國河北和寧夏，是一種傳統(tǒng)的名貴中藥材[1]，枸杞果肉中含有枸杞多糖、維生素、酚類、生物堿和黃酮等多種活性成分[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖是枸杞提取物中最主要的功能成分，有降血糖、降血壓、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物學(xué)功能[4-7]。黃芪，又名綿芪、綿黃芪，主要分布于我國西北、華北和東北等地區(qū)，具有很高的藥用價(jià)值。黃芪多糖是黃芪的主要成分之一，大量研究表明，黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血脂等功能[8-12]。

多糖是由10個(gè)以上的單糖分子通過糖苷鍵連接而成的天然高分子化合物[13]。據(jù)研究報(bào)道，植物多糖的提取方法有多種，例如熱水浸提法、超聲波輔助提取法、酸堿水解提取法、酶法提取法等[14-17]。植物多糖作為一種生物活性大分子物質(zhì)，在維持人體機(jī)能、提高人體免疫力、抗腫瘤、抗菌消炎、降低血糖等方面發(fā)揮著重要的作用[18-21]。因此，提高多糖的提取率對枸杞和黃芪資源的開發(fā)具有重要意義。

該試驗(yàn)主要利用加熱、超聲波、生物酶等多種輔助手段提取紅、黑枸杞黃芪混合物中的多糖，篩選出提取率最高的提取方法，為藥用植物多糖的生產(chǎn)提供有效的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

紅枸杞、黑枸杞、黃芪（購自青島大潤發(fā)超市）；果膠酶、纖維素酶、苯酚、濃硫酸、葡萄糖（由實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.2 儀器與設(shè)備

XF-20C粉碎機(jī)（青島海泰生物技術(shù)有限公司）；WFZUV-2000紫外可見分光光度計(jì)（美國貝克曼公司）；HH-4A水浴鍋（常州國華電器有限公司）；KQ-600DE超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；AR1140電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LYOQUEST-55冷凍干燥機(jī)（西班牙Telstar公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

將烘干后的紅枸杞、黑枸杞和黃芪分別置于粉碎機(jī)中粉碎成粉末，分別按照1∶1質(zhì)量比將枸杞與黃芪混合，得到紅枸杞黃芪和黑枸杞黃芪2種混合物粉末。

1.2.2 枸杞黃芪復(fù)合粗多糖的提取方法

1.2.2.1 傳統(tǒng)提取法

分別準(zhǔn)確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照1∶10（g/mL）料液比添加蒸餾水，攪拌均勻置于45 ℃水浴鍋中熱水浸提70 min，浸提液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。同理，將水浴鍋溫度設(shè)置成85 ℃，按照上述方法處理，得到85 ℃下提取的紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。將45℃和85 ℃下傳統(tǒng)提取方法分別用T-45和T-85表示。

1.2.2.2 超聲波提取法

分別準(zhǔn)確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照1∶10（g/mL）料液比添加蒸餾水，攪拌均勻后進(jìn)行超聲波處理70 min，超聲溫度設(shè)置45 ℃，超聲功率350 W，工作頻率80 kHz。料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。將超聲提取方法用U表示。

1.2.2.3 酶提取法

（1）膠酶提取

分別準(zhǔn)確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.4%的果膠酶攪拌均勻，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。將果膠酶提取方法用P表示。

（2）纖維素酶提取

分別準(zhǔn)確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.4%的纖維素酶攪拌均勻，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。將纖維素酶提取方法用C表示。

（3）果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取

分別準(zhǔn)確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.2%的果膠酶和0.2%的纖維素酶攪拌均勻，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。將果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取方法用PC表示。

1.2.2.4 超聲波提取法和酶法聯(lián)合提取法

（1）超聲波與果膠酶聯(lián)合提取

分別準(zhǔn)確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.4%的果膠酶攪拌均勻后進(jìn)行超聲波處理70 min，超聲溫度設(shè)置45 ℃，超聲功率350 W，工作頻率80 kHz。料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。將超聲波與果膠酶聯(lián)合提取方法用UP表示。

（2）超聲波與纖維素酶聯(lián)合提取

分別準(zhǔn)確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.4%的纖維素酶攪拌均勻后進(jìn)行超聲波處理70 min，超聲溫度設(shè)置45 ℃，超聲功率350 W，工作頻率80 kHz。料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。將超聲波與纖維素酶聯(lián)合提取方法用UC表示。

（3）超聲波、果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取

分別準(zhǔn)確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.2%的果膠酶和0.2%的纖維素酶攪拌均勻后進(jìn)行超聲波處理70 min，超聲溫度設(shè)置為45 ℃，超聲功率350 W，工作頻率80 kHz。料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖。將超聲波、果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取方法用UPC表示。

1.2.3 粗多糖的測定

將不同提取方法下冷凍干燥得到的18種紅、黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖，分別稱量并用式（1）計(jì)算得率。

粗多糖得率=w/W×100% （1）式中：w為提取液冷凍干燥后質(zhì)量，g；W為提取前稱取的紅、黑枸杞黃芪混合物質(zhì)量，g

1.2.4 多糖含量的測定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取50.0 mg（精確到0.1 mg）烘干的葡萄糖，加水溶解并定容至50 mL容量瓶，混勻，得到1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成質(zhì)量濃度分別為20，40，60，80和100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別移取1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速加入6.0 mL濃硫酸，在室溫放置30 min，以水為空白對照，用紫外可見分光光度計(jì)測定其在490 nm波長處的吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.3 樣品溶液的配制及測定

分別稱取10 mg 9種提取方法得到的紅枸杞黃芪復(fù)合粗多糖和黑枸杞黃芪復(fù)合粗多糖，加水溶解定容至100 mL容量瓶，搖勻，得到18種枸杞黃芪復(fù)合粗多糖溶液。移取1.0 mL樣品溶液于試管中，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，然后快速加入6.0 mL濃硫酸，室溫放置30 min，以水為空白對照，用紫外可見分光光度計(jì)測定其在490 nm波長處的吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算多糖含量。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

按1.2.4.3小節(jié)的方法配制枸杞黃芪復(fù)合粗多糖溶液，分別吸取6份1 mL樣液進(jìn)行試驗(yàn)，利用苯酚-硫酸法測定樣液，通過顯色反應(yīng)測定其在490 nm波長處的吸光度。通過比較6份樣液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），考察不同提取方法的精密度。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按1.2.4.3小節(jié)的方法配制枸杞黃芪復(fù)合粗多糖溶液，分別在室溫放置0，1，2，3，4和5 h，利用苯酚-硫酸法測定不同時(shí)間段樣液在490 nm波長處的吸光度。通過比較樣液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），考察5 h內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅、黑枸杞黃芪混合物中粗多糖的得率

由圖1可知：在傳統(tǒng)提取方法下，高溫對黑枸杞黃芪復(fù)合物中粗多糖的提取影響較大；單一提取方法下，果膠酶提取較其他方法對紅、黑枸杞黃芪復(fù)合物中粗多糖的提取效果較好；聯(lián)合提取方法下，雙酶提取和超聲波與果膠酶提取效果較好，說明果膠酶對紅、黑枸杞黃芪復(fù)合物中粗多糖的提取影響較大。

圖1 不同提取方法下紅、黑枸杞黃芪混合物中粗多糖得率

2.2 粗多糖中多糖含量

按1.2.4.2小節(jié)的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程：y=0.003 7x-0.005 5（R2=0.997 3）。根據(jù)回歸方程求得18種粗多糖溶液中多糖含量。由圖2可知，傳統(tǒng)提取法和超聲波提取方法提取的紅、黑枸杞黃芪粗多糖中的多糖含量低于50%，單酶提取比果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取的紅、黑枸杞黃芪粗多糖中的多糖含量高，分別能達(dá)到94.33%和78.12%，說明果膠酶與纖維素酶聯(lián)合使用能促使其他成分的溶出。超聲波與酶法聯(lián)合提取的紅、黑枸杞黃芪粗多糖中的多糖含量相對較高，分別能達(dá)到86.33%和95.69%。

圖2 不同提取方法下粗多糖溶液中多糖含量

2.3 紅、黑枸杞黃芪混合物中多糖得率

由圖3可知，傳統(tǒng)提取法和超聲波提取法提取的紅、黑枸杞黃芪復(fù)合多糖得率較低，最高不到10%。果膠酶提取和纖維素酶提取要比雙酶聯(lián)合提取的紅、黑枸杞黃芪復(fù)合多糖得率高，說明雙酶聯(lián)合提取不如單酶提取效果好。超聲波與酶法聯(lián)合提取方法中，超聲波與果膠酶聯(lián)合提取紅、黑枸杞黃芪復(fù)合多糖得率最高，分別能達(dá)到23.29%和18.77%。

圖3 不同提取方法下紅、黑枸杞黃芪混合物中多糖得率

2.4 精密度

6份樣液顯色反應(yīng)后，對490 nm波長處的吸光度進(jìn)行分析，其吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）在0.21%～0.97%之間，說明該方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性

枸杞黃芪復(fù)合粗多糖溶液在室溫放置0，1，2，3，4和5 h后，通過顯色反應(yīng)，對490 nm波長處的吸光度進(jìn)行分析，其吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）小于1.1%，說明該方法在5 h內(nèi)測定是穩(wěn)定的。

3 結(jié)論

以紅枸杞、黑枸杞和黃芪原料，制備紅枸杞黃芪混合物與黑枸杞黃芪混合物，通過多種方法提取紅、黑枸杞黃芪混合物中的復(fù)合粗多糖，利用苯酚硫酸法測定其中多糖的含量并進(jìn)行比較，最佳提取方法為超聲波與果膠酶聯(lián)合提取法，即0.4%果膠酶、超聲波處理70 min、超聲溫度45 ℃、超聲功率350 W、工作頻率80 kHz，多糖得率分別為23.29%和18.77%，比傳統(tǒng)提取法提高634.7%和463.7%。因此，超聲波與果膠酶聯(lián)合提取是一種有效提取多糖的方法。