枸杞黃芪復合多糖多種提取方法的比較

蓋永強，藍天嬋，張樂宏，鄭卓琦，樸美子，李巖

青島農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院（青島 266109）

枸杞屬茄科落葉灌木，主要產(chǎn)于我國河北和寧夏，是一種傳統(tǒng)的名貴中藥材[1]，枸杞果肉中含有枸杞多糖、維生素、酚類、生物堿和黃酮等多種活性成分[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖是枸杞提取物中最主要的功能成分，有降血糖、降血壓、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等生物學功能[4-7]。黃芪，又名綿芪、綿黃芪，主要分布于我國西北、華北和東北等地區(qū)，具有很高的藥用價值。黃芪多糖是黃芪的主要成分之一，大量研究表明，黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血脂等功能[8-12]。

多糖是由10個以上的單糖分子通過糖苷鍵連接而成的天然高分子化合物[13]。據(jù)研究報道，植物多糖的提取方法有多種，例如熱水浸提法、超聲波輔助提取法、酸堿水解提取法、酶法提取法等[14-17]。植物多糖作為一種生物活性大分子物質(zhì)，在維持人體機能、提高人體免疫力、抗腫瘤、抗菌消炎、降低血糖等方面發(fā)揮著重要的作用[18-21]。因此，提高多糖的提取率對枸杞和黃芪資源的開發(fā)具有重要意義。

該試驗主要利用加熱、超聲波、生物酶等多種輔助手段提取紅、黑枸杞黃芪混合物中的多糖，篩選出提取率最高的提取方法，為藥用植物多糖的生產(chǎn)提供有效的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

紅枸杞、黑枸杞、黃芪（購自青島大潤發(fā)超市）；果膠酶、纖維素酶、苯酚、濃硫酸、葡萄糖（由實驗室提供）。

1.1.2 儀器與設備

XF-20C粉碎機（青島海泰生物技術有限公司）；WFZUV-2000紫外可見分光光度計（美國貝克曼公司）；HH-4A水浴鍋（常州國華電器有限公司）；KQ-600DE超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）；AR1140電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；TGL-16M高速臺式冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；LYOQUEST-55冷凍干燥機（西班牙Telstar公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

將烘干后的紅枸杞、黑枸杞和黃芪分別置于粉碎機中粉碎成粉末，分別按照1∶1質(zhì)量比將枸杞與黃芪混合，得到紅枸杞黃芪和黑枸杞黃芪2種混合物粉末。

1.2.2 枸杞黃芪復合粗多糖的提取方法

1.2.2.1 傳統(tǒng)提取法

分別準確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照1∶10（g/mL）料液比添加蒸餾水，攪拌均勻置于45 ℃水浴鍋中熱水浸提70 min，浸提液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。同理，將水浴鍋溫度設置成85 ℃，按照上述方法處理，得到85 ℃下提取的紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。將45℃和85 ℃下傳統(tǒng)提取方法分別用T-45和T-85表示。

1.2.2.2 超聲波提取法

分別準確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照1∶10（g/mL）料液比添加蒸餾水，攪拌均勻后進行超聲波處理70 min，超聲溫度設置45 ℃，超聲功率350 W，工作頻率80 kHz。料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。將超聲提取方法用U表示。

1.2.2.3 酶提取法

（1）膠酶提取

分別準確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.4%的果膠酶攪拌均勻，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。將果膠酶提取方法用P表示。

（2）纖維素酶提取

分別準確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.4%的纖維素酶攪拌均勻，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。將纖維素酶提取方法用C表示。

（3）果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取

分別準確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.2%的果膠酶和0.2%的纖維素酶攪拌均勻，置于45 ℃水浴中酶解70 min，料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。將果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取方法用PC表示。

1.2.2.4 超聲波提取法和酶法聯(lián)合提取法

（1）超聲波與果膠酶聯(lián)合提取

分別準確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.4%的果膠酶攪拌均勻后進行超聲波處理70 min，超聲溫度設置45 ℃，超聲功率350 W，工作頻率80 kHz。料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。將超聲波與果膠酶聯(lián)合提取方法用UP表示。

（2）超聲波與纖維素酶聯(lián)合提取

分別準確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.4%的纖維素酶攪拌均勻后進行超聲波處理70 min，超聲溫度設置45 ℃，超聲功率350 W，工作頻率80 kHz。料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。將超聲波與纖維素酶聯(lián)合提取方法用UC表示。

（3）超聲波、果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取

分別準確稱取紅枸杞黃芪混合物和黑枸杞黃芪混合物，按照料液比1∶10（g/mL）添加蒸餾水，加入質(zhì)量比0.2%的果膠酶和0.2%的纖維素酶攪拌均勻后進行超聲波處理70 min，超聲溫度設置為45 ℃，超聲功率350 W，工作頻率80 kHz。料液經(jīng)紗布過濾后，濾液在3 500 r/min，4 ℃條件下離心15 min，將上清液冷凍干燥得到紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖。將超聲波、果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取方法用UPC表示。

1.2.3 粗多糖的測定

將不同提取方法下冷凍干燥得到的18種紅、黑枸杞黃芪復合粗多糖，分別稱量并用式（1）計算得率。

粗多糖得率=w/W×100% （1）式中：w為提取液冷凍干燥后質(zhì)量，g；W為提取前稱取的紅、黑枸杞黃芪混合物質(zhì)量，g

1.2.4 多糖含量的測定

1.2.4.1 葡萄糖標準溶液的配制

準確稱取50.0 mg（精確到0.1 mg）烘干的葡萄糖，加水溶解并定容至50 mL容量瓶，混勻，得到1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液。準確移取上述標準溶液，制成質(zhì)量濃度分別為20，40，60，80和100 μg/mL的葡萄糖標準溶液。

1.2.4.2 標準曲線繪制

分別移取1.0 mL葡萄糖標準溶液于試管中，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，然后快速加入6.0 mL濃硫酸，在室溫放置30 min，以水為空白對照，用紫外可見分光光度計測定其在490 nm波長處的吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4.3 樣品溶液的配制及測定

分別稱取10 mg 9種提取方法得到的紅枸杞黃芪復合粗多糖和黑枸杞黃芪復合粗多糖，加水溶解定容至100 mL容量瓶，搖勻，得到18種枸杞黃芪復合粗多糖溶液。移取1.0 mL樣品溶液于試管中，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，然后快速加入6.0 mL濃硫酸，室溫放置30 min，以水為空白對照，用紫外可見分光光度計測定其在490 nm波長處的吸光度，帶入標準曲線方程中計算多糖含量。

1.2.5 精密度試驗

按1.2.4.3小節(jié)的方法配制枸杞黃芪復合粗多糖溶液，分別吸取6份1 mL樣液進行試驗，利用苯酚-硫酸法測定樣液，通過顯色反應測定其在490 nm波長處的吸光度。通過比較6份樣液的相對標準偏差（SRSD），考察不同提取方法的精密度。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗

按1.2.4.3小節(jié)的方法配制枸杞黃芪復合粗多糖溶液，分別在室溫放置0，1，2，3，4和5 h，利用苯酚-硫酸法測定不同時間段樣液在490 nm波長處的吸光度。通過比較樣液的相對標準偏差（SRSD），考察5 h內(nèi)樣品溶液的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 紅、黑枸杞黃芪混合物中粗多糖的得率

由圖1可知：在傳統(tǒng)提取方法下，高溫對黑枸杞黃芪復合物中粗多糖的提取影響較大；單一提取方法下，果膠酶提取較其他方法對紅、黑枸杞黃芪復合物中粗多糖的提取效果較好；聯(lián)合提取方法下，雙酶提取和超聲波與果膠酶提取效果較好，說明果膠酶對紅、黑枸杞黃芪復合物中粗多糖的提取影響較大。

圖1 不同提取方法下紅、黑枸杞黃芪混合物中粗多糖得率

2.2 粗多糖中多糖含量

按1.2.4.2小節(jié)的方法繪制標準曲線，得線性回歸方程：y=0.003 7x-0.005 5（R2=0.997 3）。根據(jù)回歸方程求得18種粗多糖溶液中多糖含量。由圖2可知，傳統(tǒng)提取法和超聲波提取方法提取的紅、黑枸杞黃芪粗多糖中的多糖含量低于50%，單酶提取比果膠酶與纖維素酶聯(lián)合提取的紅、黑枸杞黃芪粗多糖中的多糖含量高，分別能達到94.33%和78.12%，說明果膠酶與纖維素酶聯(lián)合使用能促使其他成分的溶出。超聲波與酶法聯(lián)合提取的紅、黑枸杞黃芪粗多糖中的多糖含量相對較高，分別能達到86.33%和95.69%。

圖2 不同提取方法下粗多糖溶液中多糖含量

2.3 紅、黑枸杞黃芪混合物中多糖得率

由圖3可知，傳統(tǒng)提取法和超聲波提取法提取的紅、黑枸杞黃芪復合多糖得率較低，最高不到10%。果膠酶提取和纖維素酶提取要比雙酶聯(lián)合提取的紅、黑枸杞黃芪復合多糖得率高，說明雙酶聯(lián)合提取不如單酶提取效果好。超聲波與酶法聯(lián)合提取方法中，超聲波與果膠酶聯(lián)合提取紅、黑枸杞黃芪復合多糖得率最高，分別能達到23.29%和18.77%。

圖3 不同提取方法下紅、黑枸杞黃芪混合物中多糖得率

2.4 精密度

6份樣液顯色反應后，對490 nm波長處的吸光度進行分析，其吸光度的相對標準偏差（SRSD）在0.21%～0.97%之間，說明該方法精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性

枸杞黃芪復合粗多糖溶液在室溫放置0，1，2，3，4和5 h后，通過顯色反應，對490 nm波長處的吸光度進行分析，其吸光度的相對標準偏差（SRSD）小于1.1%，說明該方法在5 h內(nèi)測定是穩(wěn)定的。

3 結論

以紅枸杞、黑枸杞和黃芪原料，制備紅枸杞黃芪混合物與黑枸杞黃芪混合物，通過多種方法提取紅、黑枸杞黃芪混合物中的復合粗多糖，利用苯酚硫酸法測定其中多糖的含量并進行比較，最佳提取方法為超聲波與果膠酶聯(lián)合提取法，即0.4%果膠酶、超聲波處理70 min、超聲溫度45 ℃、超聲功率350 W、工作頻率80 kHz，多糖得率分別為23.29%和18.77%，比傳統(tǒng)提取法提高634.7%和463.7%。因此，超聲波與果膠酶聯(lián)合提取是一種有效提取多糖的方法。