高效液相色譜測定飲料中亮藍合成著色劑條件的優化

金慧慧

溫州市龍灣區疾病預防控制中心（溫州 325024）

參照現行有效標準GB 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測定》，在試驗中發現，在254 nm下檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅都能得到明顯的響應值，唯獨亮藍響應值低且難以分離[1]。不僅如此，該方法前處理步驟復雜，而且試驗回收率偏低，由于需要通過漏斗真空抽濾，考慮到漏斗和真空泵數量，不能同時大批量檢測，已不能滿足日常批量的食品風險監測任務。為此，有很多商家生產出聚酰胺小柱，可以批量高效富集并洗脫分離出合成色素，但其價格昂貴，聚酰胺粉洗脫時不能充分攪拌，柱容積也有限，很難一次將樣品溶液全部上樣，分批上樣略顯繁瑣，且底面積小，遇到糖含量高的樣品，比如果凍，提取后樣品溶液里會出現一些絮狀物質，離心后沉淀效果并不明顯，在過SPE柱時，容易出現堵塞柱子的現象[2]。試驗通過對樣品前處理步驟、樣品溶液凈化及濃縮步驟的改變，提高亮藍的回收率，同時通過自制聚酰胺小柱達到一次性全部上樣、底面積大不容易堵柱、可重復利用并且可靈活選擇聚酰胺粉填充量的效果。由于可以批量進行處理，所以極大地提高合成色素的檢測效率，能夠很好地滿足實際工作的需要[3]，為批量檢測飲料中亮藍合成著色劑提供更快速、更經濟、回收率更高的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、設備與試劑

1.1.1 儀器與設備

Waters I-class高效液相色譜儀（配PDA二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；AL204電子天平（d=0.1 mg，美特勒-托利多）；自制聚酰胺小柱（在30 mL romer免疫親和上樣專用柱內嵌合G3砂芯濾板，固定于固相萃取裝置上，相當于G3漏斗的作用）；旋渦混合器（德國IKA公司）；水浴鍋（上海精宏實驗設備）；GM 0.5A隔膜真空泵（天津津騰實驗設備）；0.22 μm針式濾膜（上海安譜公司）。

1.1.2 材料與試劑

亮藍標準，北京海岸鴻蒙，編號GBW（E）100162，質量濃度1.0 mg/mL；乙酸、氨水、乙醇、甲酸、檸檬酸、聚酰胺粉（分析純）；甲醇（色譜純）；水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水。

1.2 色譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）；波長629 nm；流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流動相：甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液（梯度洗脫，見表1）。

表1 亮藍測定的流動相梯度

1.3 標準曲線的配制

吸取1 mL亮藍標準（1.0 mg/mL）于10 mL容量瓶中，用純水稀釋至刻度，即100 mg/L，再吸取此溶液配制成0.1，1.0，10.0，20.0和30.0 mg/L的標準曲線，相關系數為0.999 1。標準曲線第二點色譜圖見圖1。

圖1 標準曲線第二點色譜圖

1.4 樣品處理方法

稱取5 g樣品放入25 mL燒杯中，含二氧化碳的樣品加熱去除二氧化碳，含乙醇的樣品加熱去除乙醇，試樣pH偏高時用檸檬酸水溶液（20%）調節至pH 3左右，加入1.0 g聚酰胺粉置于60 ℃恒溫水浴鍋中，不斷攪拌并保溫0.5 h后取出。將燒杯中樣品用10 mL水（pH 3，用20%檸檬酸溶液調節）一次性全部沖洗轉移至自制聚酰胺小柱（見圖2），棄去濾液，并用10 mL甲醇-甲酸（6∶4，V/V）、10 mL純化水（pH 6～7）淋洗，通過真空泵吹干小柱，用20 mL乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V，現用現配）分4次洗脫并接收濾液，收集液于100 ℃水浴鍋蒸干，加乙酸調節pH至中性，用純水定容至10 mL，在漩渦混合器上充分混勻后，過0.22 μm針式濾膜，待測。

圖2 自制聚酰胺小柱

2 結果與討論

2.1 聚酰胺粉吸附環境酸度的選擇

亮藍屬于人工合成色素，是由苯甲醛鄰磺酸與N-乙基-N-（3-磺基芐基）-苯胺經縮合、氧化而制得的，屬于偶氮類化合物[4]。鑒于聚酰胺粉吸附原理是在酸性條件下酰胺鍵能以氫鍵形式結合質子，表面帶著大量正電荷，容易吸附偶氮類合成色素在水中解離出的帶負電荷的大陰離子，從而形成穩定化合物，根據GB 5009.35—2016《食品安全國家標準》中“試樣pH偏高時用檸檬酸水溶液（20%）調節pH 6左右攪拌吸附”的操作，試驗分別設計pH為3，4和6時，在礦泉水中分別加標10 mg/L亮藍，進行加標回收率的比較。結果發現，pH 3時，亮藍的加標回收率最高。

表2 不同pH下聚酰胺粉吸附能力的比較結果

2.2 聚酰胺粉用量的選擇

聚酰胺粉用量也是影響吸附效果的關鍵之一，選擇0.25，0.50，1.00和2.00 g聚酰胺粉分別對加標20 mg/L亮藍的礦泉水進行加標回收率的比較，結果顯示，聚酰胺粉1.00 g時就能達到和2.00 g時差不多的效果，故選用1.00 g聚酰胺粉進行吸附洗脫。

表3 不同質量聚酰胺粉的吸附能力的比較

2.3 60 ℃水浴恒溫時長的選擇

聚酰胺粉吸附還需時間活化，對此將水浴時長進行不同的設定，比較各時長的加標回收率，由此確定，最佳時長為30 min。

表4 不同水浴時長下聚酰胺粉的吸附能力的比較

2.4 淋洗液pH的選擇

淋洗液pH分別為3，4和6時，比較亮藍加標10 mg/L時的回收率。pH 3時，回收率為95.1%；pH 4時，回收率為87.0%；pH 6時，回收率為85.2%。由此確定，最佳pH為3。

2.5 洗脫液的選擇

洗脫液主要有乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）與10%氨化甲醇2種，分別對2種洗脫液進行加標回收測試，結果顯示礦泉水中加標20 mg/L亮藍時，亮藍乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）回收率為98.7%，10%氨化甲醇回收率達95.1%，乙醇-氨水-水的效果更好，且更安全。

2.6 方法檢出限及精密度

按照該試驗條件，方法的檢出限（SLOD）和定量限（SLOQ）分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應的質量濃度計算[5]。結果顯示，亮藍0.100 mg/L的rSN為34.76，檢出限為0.009 mg/L，定量限為0.03 mg/kg。對加標10 mg/L的礦泉水進行7次精密度測試，結果分別為9.91，9.87，9.88，9.91，9.92，9.90和9.92 mg/L，平均值為9.90 mg/L，回收率為99.0%，精密度為0.20%。

3 結論

通過線性、檢出限、精密度等方法確認，此次試驗所介紹的方法符合檢驗要求，回收率高，結果準確可靠，并且可以批量檢測，節省檢測時間和資源，可用于飲料中亮藍合成色素的定量檢測。