響應(yīng)面法優(yōu)化玉米須多糖提取工藝及抑菌效果的研究

金萍，劉政，于小磊

錦州醫(yī)科大學(xué)食品與健康學(xué)院（錦州 121001）

在玉米材料加工中，玉米須一直被當(dāng)作廢棄物，沒有最大化利用好資源，根據(jù)大多數(shù)文獻(xiàn)報道酸提取法可以提高多糖得率，但有關(guān)多糖抑菌性的研究卻鮮有報道。徐彬等[1]通過正交試驗(yàn)對玉米須多糖提取工藝開展研究，優(yōu)化后的工藝參數(shù)為料液比1∶15、提取溫度90 ℃、提取時間3 h、提取次數(shù)4次，此工藝下的玉米須多糖的提取率為3.66%，純度為81.1%。劉東琦等[2]比較幾種常用的多糖提取的方法，結(jié)果表明，酶聯(lián)合超聲輔助法所得多糖提取率最高，達(dá)到9.53%。李亞平等[3]研究了利用正交試驗(yàn)的方法優(yōu)化玉米須多糖酸提取的最優(yōu)工藝，結(jié)果表明，酸提取最優(yōu)工藝條件為溫度90 ℃、鹽酸濃度0.26 mol/L、料液比1∶50（g/mL）、提取2次、每次提取80 min。在此條件下，酸提取多糖（AEP）和水提取多糖（WEP）的得率分別為33.36%和7.44%。黃俊文等[4]揭示了米須中活性成分的作用機(jī)制，有助于玉米須資源的利用及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)。由于玉米須多糖具有多種營養(yǎng)保健作用，因此玉米須深加工具有廣泛的應(yīng)用空間。試驗(yàn)對玉米須多糖的提取工藝條件及抑菌特性開展研究，以期為玉米須多糖開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

新鮮玉米須（收集自遼寧省錦州市石橋子早市）；葡萄糖（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；苯酚（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；營養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；營養(yǎng)肉湯（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；大腸桿菌（錦州醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室）；金黃色葡萄球菌（錦州醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室）；黑曲霉（錦州醫(yī)科大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

小型粉碎機(jī)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；TU-752型雙光束紫外可見分光光度計（上海儀電控股有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品）；HR型立式高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器設(shè)備有限公司）；GRX-9053A型熱空氣消毒箱（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司）；ZHJH-1112C型超凈工作臺（上海智城分析儀器有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；FD-1E-80冷凍干燥機(jī)（上海比朗儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 玉米須原材料處理與玉米須多糖的提取

把收集到的所有玉米須經(jīng)過整理后去除掉其他雜質(zhì)，將電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱調(diào)到75 ℃，干燥直至恒重，將干燥后的玉米須放到小型粉碎機(jī)中將其粉碎。將粉碎后的玉米須過0.425 mm（40目）篩網(wǎng)，裝袋密封保存?zhèn)溆谩?/p>

挑選干凈的玉米須經(jīng)粉碎后過0.180 mm（80目）孔徑篩，50 ℃下采用索氏提取裝置進(jìn)行乙醚回流48 h脫脂，按一定液料比加入蒸餾水，在不同溫度下進(jìn)行攪拌提取后，按4 000 r/min離心20 min取下層沉淀加水進(jìn)行重復(fù)提取，并分別合并收集上層提取液離心減壓濃縮[5]，采用Savage法除蛋白后得到新鮮玉米須多糖提取液，調(diào)節(jié)提取液的乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%后，在4℃冰箱中靜置24 h，按4 000 r/min離心20 min，得到玉米須多糖沉淀，在50 ℃烘干后得到玉米須粗多糖[6]。

（1）對煉廠現(xiàn)有的油漿回?zé)捄蛽綗捁に囘M(jìn)行改良和創(chuàng)新，在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，以提高催化裂化單元的回?zé)捔亢脱舆t焦化單元的摻煉量，進(jìn)而降低操作成本，提高裝置能效水平。

工藝流程：玉米須→干燥→粉碎[過0.180 mm（80目）孔徑篩]→鹽酸溶液熱回流提取（50 ℃）48 h→按一定料液比加入蒸餾水→提取→過濾→離心（4 000 r/min離心15 min）→二次提取→過濾→合并濾液→采用Sevage法除蛋白后得到新鮮玉米須多糖→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（提取液體積的1/5）→加95%乙醇至80%進(jìn)行醇沉→冰箱中靜置24 h，離心（4 000 r/min，15 min）→冷凍干燥→玉米須粗多糖。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[7]

精密稱取100 mg干燥恒重的葡萄糖，用水溶解并稀釋至刻度100 mL，備用。精密吸取10 mL備用液，加水稀釋至100 mL定容，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取100，200，300，400，500，600和700 μL標(biāo)準(zhǔn)液，分別置于試管內(nèi)，各加水至2 mL，各加入1.0 mL 5%苯酚試劑，各管迅速滴加5.0 mL濃硫酸，立刻搖勻。沸水加熱15 min，迅速冷卻，另取2 mL水，同法操作加入試劑作為空白對照，用紫外可見分光光度計在λ=490 nm測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

1.3.3 多糖抗菌活性的研究

用打孔器將濾紙打成圓濾紙片，將圓濾紙片浸潤到玉米須多糖的提取液中。將濾紙片放到接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基中，通過測量抑菌圈的直徑測定玉米須多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，具體操作步驟參考關(guān)海寧等[8]的研究方法。

1.3.4 單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)

1.3.4.1 改變液料比添加比例對多糖提取率的影響

稱取10.0 g玉米須粉于500 mL燒杯中，固定提取次數(shù)3次、提取時間3 h、提取溫度85 ℃。調(diào)節(jié)水與玉米須的添加比例，使其液料比分別為10∶1，12∶1，14∶1，16∶1和18∶1（mL/g），提取玉米須多糖，將提取出的多糖測定吸光度。

1.3.4.2 改變提取溫度對多糖提取率的影響

稱取10.0 g玉米須粉于500 mL燒杯中，選取提取時間3 h、提取次數(shù)3次、液料比16∶1（mL/g），改變提取溫度80，85，90，95和100 ℃，按1.3.1的方法提取玉米須多糖[9]，按1.3.2的方法測其吸光度。

1.3.4.3 提取時間對多糖提取率的影響

稱取10.0 g玉米須粉于500 mL燒杯中，選取液料比16∶1（mL/g）、提取溫度85 ℃、水提次數(shù)2次，改變提取時間1，2，3，4和5 h，按1.3.1的方法提取玉米須多糖，按1.3.2的方法測其吸光度，根據(jù)吸光度換算多糖濃度。利用式（1）計算出多糖的提取率。

提取率=多糖濃度（mg/mL）×稀釋倍數(shù)×所得提取液體積（mL）/玉米須質(zhì)量（g）×100% （1）

1.3.4.4 提取次數(shù)對提取率的影響

稱取10.0 g玉米須粉于500 mL燒杯中，選取提取溫度85 ℃、提取時間3 h、液料比16∶1（mL/g），改變提取次數(shù)1，2，3，4和5次，提取玉米須多糖，按1.3.2的方法測其吸光度，計算出多糖的提取率。

1.3.4.5 玉米須多糖提取液對細(xì)菌生長的影響

用打孔器將濾紙打成直徑9 mm的圓濾紙片，與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基一同在121 ℃條件下滅菌20 min。制作培養(yǎng)基平皿，用無菌移液槍吸取菌懸液，涂布均勻。將滅菌后的濾紙片浸入玉米須多糖的提取液中30 min，用無菌鑷子取出，晾干，平鋪于含有涂布細(xì)菌的凝固培養(yǎng)基中，倒置放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察測量抑菌圈的直徑。

1.3.4.6 響應(yīng)面因素水平設(shè)計表

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計表

2 結(jié)果與分析

2.1 液料比對提取率的影響

由圖1可以看出，液料比在10∶1（mL/g）至18∶1（mL/g）時，隨著水的添加比例增加，多糖提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，液料比16∶1（mL/g）時提取率達(dá)到最大值3.9%。因此，選取16∶1（mL/g）為較佳液料比。

圖1 料液比對提取率的影響

2.2 提取溫度對提取率的影響

由圖2可看出，溫度在75 ℃至85 ℃時，提取率呈上升趨勢，在85 ℃時提取率達(dá)到4.08%，溫度大于85℃時，提取率開始下降。因此選取85 ℃為較佳的提取溫度。

圖2 提取溫度對提取率的影響

2.3 提取時間對提取率的影響

由圖3可看出，提取時間1～3 h時，測得的多糖提取率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，提取時間為3 h時，多糖的提取率達(dá)到3.98%。提取時間超過3 h以后，多糖提取率出現(xiàn)降低的趨勢。因此，較佳的提取時間為3 h。

圖3 提取時間對提取率的影響

2.4 提取次數(shù)對提取率的影響

由圖4可以看出，提取次數(shù)1～3次時，多糖提取率呈現(xiàn)上升趨勢。提取次數(shù)為3次時，提取率為4.13%。提取次數(shù)大于3次時，玉米須多糖的提取率呈現(xiàn)下降趨勢。所以較佳的提取次數(shù)為3次。

圖4 提取次數(shù)對提取率的影響

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

以液料比、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間為自變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，根據(jù)表2響應(yīng)面試驗(yàn)分析方案，對各因素的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，建立玉米須多糖的提取率與水提條件的二次多項(xiàng)式方程：Y=4.76-0.1X1+0.18X2-0.12X3-0.17X4-0.05X1X2-0.17X1X3-0.27X1X4+0.4X2X3-0.35X2X4+0.32X3X4-1.08-1.15-0.55-0.10。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果

圖6 提取溫度 液料比等高線圖

圖7 提取次數(shù)、液料比等高線圖

根據(jù)表3響應(yīng)面方差分析結(jié)果可知，這個模型極顯著（P＜0.01），F(xiàn)值為97.28，證明模型可用，且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），誤差較小，試驗(yàn)不存在失擬的因素，準(zhǔn)確顯示各提取因素對玉米須多糖提取率的影響。根據(jù)P值和F值的大小可知，各因素對玉米須多糖的提取率影響大小依次為B＞D＞C＞A，即提取溫度＞提取時間＞提取次數(shù)＞液料比。各因素間的等高線圖和3D圖如圖5～圖16所示。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

圖5 提取時間、液料比等高線圖

圖8 提取時間、提取溫度等高線圖

圖9 提取次數(shù)、提取溫度等高線圖

圖10 提取次數(shù)、提取時間等高線圖

圖11 提取溫度、液料比3D圖

圖16 提取次數(shù)、提取時間3D圖

圖12 提取時間、液料比3D圖

圖13 提取次數(shù)、液料比3D圖

圖14 提取時間、提取溫度3D圖

圖15 提取次數(shù)、提取溫度3D圖

2.6 最佳提取條件的確定

通過Design Expert 12.0軟件求解所得回歸方程，得出玉米須多糖最優(yōu)提取工藝條件：液料比15.95∶1（mL/g）、提取溫度85.39 ℃、提取時間3.9 h、提取次數(shù)2.9次。預(yù)測的玉米須多糖提取率為4.782 79%。考慮到在試驗(yàn)過程的可操作性，將玉米須多糖提取的最佳工藝調(diào)整為液料比16∶1（mL/g）、提取溫度85 ℃、提取時間4 h、提取次數(shù)3次，按照最佳工藝條件進(jìn)行試驗(yàn)，用以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度，共設(shè)置5次平行試驗(yàn)，玉米須多糖平均提取率為4.79%。證明試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度較高，與預(yù)測值基本相符，表明方法可行。

2.7 玉米須多糖的抑菌效果

對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉3種細(xì)菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，由表4可看出，在圓濾紙片的周圍均出現(xiàn)抑菌圈，說明玉米須多糖提取液對這3種細(xì)菌的生長都有抑制作用。從抑菌圈直徑大小可以看出，玉米須多糖對金黃色葡萄球菌的抑制作用最明顯。

表4 玉米須多糖抑菌效果的測定結(jié)果 單位：mm

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可得出：提取玉米須多糖的最優(yōu)工藝條件為提取時間4 h、提取溫度85 ℃、提取次數(shù)3次、液料比16∶1（mL/g）。在此試驗(yàn)條件下對試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，玉米須多糖提取率為4.79%，基本與響應(yīng)面模型的理論預(yù)測值相符。試驗(yàn)提取條件和因素水平設(shè)置合理，試驗(yàn)處理較少，證明此模型預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確，可用于玉米須多糖提取的工藝優(yōu)化。