液質(zhì)聯(lián)用快速檢測(cè)保健酒中4種非法添加物質(zhì)

黃霞

宜賓市敘州區(qū)食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（宜賓 644699）

在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17204—2008[1]《飲料酒分類》中，保健酒屬于配制酒（露酒），英文名字為blended alcoholic beverage類，其定義為：以發(fā)酵酒、蒸餾酒或食用酒精為酒基，加入可食用或藥食兩用的輔料或食品添加劑，進(jìn)行調(diào)配、混合或再加工制成的，已改變了其原酒基風(fēng)格的飲料酒。保健酒包括植物類配制酒、動(dòng)物類配制酒、動(dòng)植物類配制酒及其他類配制酒4大類。保健酒在中國(guó)的歷史源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體的功能，以達(dá)到滋補(bǔ)養(yǎng)生、強(qiáng)身健體的作用[2]。它適用于特定人群食用，并不以治療為目的，根據(jù)其功能，可分為補(bǔ)氣、補(bǔ)血、滋陰、補(bǔ)陽(yáng)和氣血雙補(bǔ)等類型，同時(shí)它必須具備有三種屬性：即食品屬性、功能屬性、具有特定的功能、非藥品屬性[3]。一些不法商家為了吸引消費(fèi)者以謀取暴利，隨意添加短期內(nèi)見(jiàn)效快、副作用大的化學(xué)藥物，而且非法添加的藥物劑量隨意[4-5]，為消費(fèi)者的健康埋下了隱患[6-10]。有關(guān)監(jiān)管部門(mén)也投入了大量人力、物力打擊非法添加的行為，但還是屢禁不止[11-14]，使通常起效慢的中藥和保健食品似乎具備了速效、高效的優(yōu)點(diǎn)[15]。所以在監(jiān)管中采用高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)這些非法添加的藥物進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，以此作為這些非法活動(dòng)的有力證據(jù)，對(duì)此類違法行為進(jìn)行打擊。此次研究就是采用液質(zhì)聯(lián)用的方法同時(shí)檢測(cè)保健酒中的4種非法添加物質(zhì)。

高效液相色譜（HPLC）是以液體作為流動(dòng)相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。高效液相的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因此應(yīng)用范圍廣。近年來(lái)高效液相色譜法在藥物分析中占主要地位，據(jù)《美國(guó)藥典》22版記載，HPLC在含量測(cè)定方法中位居第一。

質(zhì)譜（MS）是強(qiáng)有力的結(jié)構(gòu)解析工具，能夠?yàn)榻Y(jié)構(gòu)定性提供較多的信息，是理想的色譜檢測(cè)器，不僅特異，而且具有極高的檢測(cè)靈敏度。串聯(lián)質(zhì)譜法是質(zhì)量分離的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，在單級(jí)質(zhì)譜給出化合物相對(duì)分子量的信息后，對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級(jí)裂解，進(jìn)而獲得豐富的化合物碎片信息，確認(rèn)目標(biāo)化合物，對(duì)目標(biāo)化合物定量[15-17]。

液質(zhì)聯(lián)用即高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（highperformance liquid chromatography-mass spectrome-try，HPLC-MS/MS），它將液相色譜和質(zhì)譜連接，把色譜的分離能力與高分辨質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度和高定性能力相結(jié)合，適合復(fù)雜成分、痕量物質(zhì)的分析，并能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息。

近年來(lái)三重四級(jí)桿質(zhì)譜在食品安全分析中得到了廣泛的應(yīng)用，它通常采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）模式，通過(guò)選擇母離子，優(yōu)化碰撞能量、去簇電壓等質(zhì)譜條件，用子離子進(jìn)行定量和定性分析。在食品添加劑、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、工業(yè)染料等非法添加物的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。

近年來(lái)，一些不法商人為牟取暴利，在中成藥、保健品和食品中非法添加化學(xué)藥物，患者在不知情的情況下大量服用，可能造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，嚴(yán)重威脅到人類健康。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以其靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多地應(yīng)用到非法添加藥物成分的鑒別中，成為打假治劣的一把利劍[18-22]。

1 材料與試劑

1.1 材料與試劑

阿司匹林（批號(hào)：100113-201405，含量99.8%，中檢院）；雙氯芬酸鈉（批號(hào)：100334-200302，中檢院）；布洛芬（批號(hào)：100179-201406，含量99.5%，中檢院）；吲哚美辛（批號(hào)：100258-200904，含量99.9%，中檢院）；甲醇（色譜純，山東大禹）；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水；待測(cè)樣品為市售隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用儀[AB 4500Qtrap，日本島津；液相色譜LC-20AT，電噴霧離子源（ESI）]；十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ODS-3 C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速0.8 mL/min；流動(dòng)相為10 mmol/L乙酸銨水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫：0～4 min，20%～95%B；4～7 min，95% B；7.1～10 min；20% B。柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜配電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子模式；氣簾氣（CUR）35 psi；離子化電壓（IS）4 500 V；離子源溫度（TEM）550 ℃；噴霧氣（GS1）60 psi；輔助加熱氣（GS2）70 psi，碰撞氣（CAD）Medium。掃描方式為選擇離子掃描（MRM）。

1.3.3 對(duì)照品溶液的配置

分別精密稱取各對(duì)照品5 mg左右于50 mL容量瓶中，加50%甲醇水溶解并定容至刻度線，再分別精密吸取0.1 mL于同一100 mL容量瓶中，50%甲醇水溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度約為100 ng/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.3.4 供試品溶液的制備

精密吸取保健酒25 mL于50 mL容量瓶中，50%甲醇水定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾膜，即得，上液質(zhì)檢測(cè)。

1.3.5 質(zhì)譜特征

取混合對(duì)照品溶液，按2.1小節(jié)色譜條件，2.2小節(jié)質(zhì)譜條件檢測(cè)。部分化學(xué)成分不能達(dá)到完全分離，但因各待測(cè)成分的離子碎片不同，通過(guò)質(zhì)譜的高靈敏和高選擇測(cè)定，不會(huì)造成相互間的干擾。4種化合物的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 四種待測(cè)組分信息

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 母離子

Q1SCAN全掃，確定母離子的質(zhì)荷比，根據(jù)這四種待測(cè)組分的化合物性質(zhì)，選擇離子源為電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式掃描，掃描范圍為分子量的正負(fù)50，掃描時(shí)間為2 min，在確定不是干擾離子的情況下選擇響應(yīng)值最高的質(zhì)荷比，準(zhǔn)確到小數(shù)點(diǎn)后一位。得到待測(cè)組分的母離子。

2.1.2 找到對(duì)應(yīng)母離子的子離子

選擇采集方法為MS2，采集模式和母離子一致，將去簇電壓（DP）從20開(kāi)始采集，依次增加到母離子的響應(yīng)值強(qiáng)度為圖片最高峰響應(yīng)值的1/4左右。當(dāng)總離子流圖（TIC）平滑后，選擇響應(yīng)值最高的子離子。

2.1.3 優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）

優(yōu)化母離子的去簇電壓（DP）和子離子的碰撞能量（CE），將DP設(shè)置為60，掃描5～180范圍內(nèi)的碰撞能量（CE），選擇響應(yīng)值最高的CE值（具體值見(jiàn)表1），確定CE值以后將DP范圍設(shè)置為5～300掃描，得到響應(yīng)值最高的DP值（具體值見(jiàn)表1）。建立MRM方法。

2.2 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)待測(cè)組分布洛芬、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛和阿司匹林是酸性化合物，所有待測(cè)成分在反相色譜中均能有效保留且在質(zhì)譜電離時(shí)帶負(fù)電，選擇普通的C18色譜柱就能很好地滿足檢測(cè)需要。同時(shí)因?yàn)槭秦?fù)離子檢測(cè)模式，故使用能促進(jìn)電離的乙酸銨水溶液，能達(dá)到更高的響應(yīng)值。

此方法通過(guò)優(yōu)化4種待測(cè)組分的流動(dòng)相，找到4種待測(cè)組分的母離子、子離子及最佳的去簇電壓（DP）及碰撞能量（CE），能簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出保健酒中的此4種非法添加。真正實(shí)現(xiàn)了快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的目的。目前液質(zhì)聯(lián)用在很多地方還不是很普及，所以因?yàn)閮x器受限，只能在有這種儀器的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，未來(lái)隨著此種儀器的普及，將會(huì)更加容易推廣此種方法。

2.3 樣品測(cè)定

按1.3.4小節(jié)制備供試品溶液，在上述色譜和質(zhì)譜條件下，共測(cè)21批樣品，全部為保健酒，其中一批檢測(cè)出阿司匹林。標(biāo)準(zhǔn)品定量離子色譜圖見(jiàn)圖1～圖4。阿司匹林陽(yáng)性樣品定量離子色譜圖見(jiàn)圖5～圖8。

圖1 布洛芬標(biāo)準(zhǔn)品定量離子色譜圖

圖2 雙氯芬酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品定量離子色譜圖

圖3 吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)品定量離子色譜圖

圖4 阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)品定量離子色譜圖

圖5 布洛芬樣品定量離子色譜圖

圖6 雙氯芬酸鈉樣品定量離子色譜圖

圖7 吲哚美辛樣品定量離子色譜圖

圖8 陽(yáng)性（阿司匹林）樣品定量離子色譜圖

因?yàn)楸＝【苹w復(fù)雜，用液相檢測(cè)時(shí)，通常雜質(zhì)較多，不易分開(kāi)，導(dǎo)致假陽(yáng)性，或目標(biāo)峰和雜峰分不開(kāi)，而無(wú)法準(zhǔn)確定量。同時(shí)非法添加的化學(xué)藥品含量極低，通常為痕量級(jí)別，液相的檢出限太高，導(dǎo)致痕量的非法添加無(wú)法檢出。文章采用液質(zhì)聯(lián)用的方法，以母離子、子離子、離子響應(yīng)值比率及出峰時(shí)間來(lái)準(zhǔn)確定性，以響應(yīng)值高的子離子碎片準(zhǔn)確定量?？梢钥焖佟?zhǔn)確地獲得高質(zhì)量、高分辨率和高靈敏度的多級(jí)質(zhì)譜信息，準(zhǔn)確快速地驗(yàn)證非法添加的化學(xué)成分，對(duì)供試品進(jìn)行結(jié)果確證，提高檢測(cè)的專屬性。