改進QuEChERS法快速測定雞蛋和雞肉中氯苯胍

鞏婧婷，王遠，李先義，羅瑞峰，張金磊，羅小玲

新疆農墾科學院分析測試中心（石河子 832000）

球蟲病是一種有極強傳染性的腸道寄生蟲病[1-2]，由于規模化的養殖、飼養密度大、家禽管理系統不良等因素導致球蟲病容易爆發呈常年流行[3-5]。現階段藥物防治球蟲病經濟成本低、起效快而養殖戶所青睞[6-8]。氯苯胍屬于胍基衍生物，分子式是C15H14Cl3N5，屬于為化學合成抗球蟲藥。因不良反應輕、易吸收、對急慢性球蟲病均有良好效果[9-11]。鹽酸氯苯胍是一種難以直接被降解的物質，不規范使用不但會使雞產生耐藥性，而且會影響雞相關產品品質。長期食用高殘留氯苯胍食品可使消費者的身體健康受到傷害[12]。

氯苯胍常用的檢測方法有高效液相色譜法[13]、液相色譜-串聯質譜法[14-15]等。但液相色譜法耗時長且容易出現假陽性，故選擇液相色譜-串聯質譜法來提高檢測效率和準確性。普通前處理試劑和耗材消耗大，繁瑣費時成本高。因此試驗擬采用QuEChERS法進行前處理，通過對色譜和質譜條件的優化，建立LC-MS/MS法快速測定雞肉和雞蛋中的氯苯胍。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈、甲醇、甲酸（HPLC級，德國CNW公司）；正己烷（AR，天津市致遠化學試劑有限公司）；超純水；雞蛋、雞肉經勻漿機處理后裝入樣品瓶中置于-20 ℃下冷凍儲存備用。

1.2 儀器設備

液質聯用儀（Agilent 1200+6460型，美國Agilent公司）；漩渦混合器（MS3 basic，德國IKA公司）；高速冷凍離心機（Multifuge X Pro Series，Thermo Fisher Scientific公司）；超聲波清洗器（KQ-600DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；超純水儀（IQ7000，美國MilliQ公司）；電子天平[BSA4202S-CW，Sartorius科學儀器（北京）有限公司]。

1.3 標準溶液的配制

購買溶解在甲醇中的鹽酸氯苯胍標準品溶液1 000 μg/mL，置于-20 ℃下避光保存。用甲醇將標準品溶液逐級稀釋并配制成1，2，5，10，20和50 ng/mL的氯苯胍系列工作溶液，置于4 ℃下避光保存。

1.4 樣品預處理

雞肉去骨、雞蛋破殼后用勻漿機攪打混勻后準確稱取2.00 g雞肉/雞蛋于50 mL離心管中，加入20 mL的0.2%甲酸乙睛水（80∶20，V/V）溶液提取，渦旋離心1 min后35 ℃下恒溫超聲提取15 min；以10 000 r/min高速離心5 min后，取5 mL上清液轉移至10 mL離心管中并加入5 mL乙睛飽和的正己烷渦旋30 s后，在5 000 r/min下離心5 min棄去正己烷，加入5 mL正己烷重復操作1遍，向溶液中加入50 mg C18粉末渦旋30 s，以5 000 r/min離心5 min后，經0.2 μm聚四氟乙烯疏水性濾膜過濾裝入進樣瓶，供HPLC-MS/MS分析。

1.5 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-AqSolvent Saver Plus（3.0 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃；流動相組成：0.1%甲酸水-乙睛（梯度）；進樣量5 μL；流速0.6 mL/min，梯度洗脫。梯度洗脫程序（見表1）。

表1 以0.1%甲酸水-乙腈為流動相的梯度洗脫程序

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；質譜掃描方式為多反應監測（MRM）；毛細管電壓4 000 V，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流量10 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速12 L/min。氯苯胍監測離子、碰撞電壓和碰撞能量等質譜參數如表2所示。

表2 氯苯胍的質譜參數

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

在電噴霧電離和MRM模式下對10 ng/mL的氯苯胍標準溶液多次注射進樣。通過對鞘氣的溫度、鞘氣的流速，毛細管的電壓、碰撞電壓和碰撞能量等參數進行過優化。選擇穩定性好、離子豐度高和干擾小的2個碎片離子作為氯苯胍定性離子和定量離子，并以豐度最強，響應值最高的作為定量離子對。標準溶液質量濃度為10 ng/mL的氯苯胍MRM離子對質譜圖（如圖1）。

圖1 氯苯胍的MRM離子對質譜圖

2.2 色譜條件優化

通過比較同一濃度下氯苯胍在水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈5種流動相體系下的峰面積和峰高，結果發現：當流動相為A、B體系時，基線噪音大、峰不對稱且拖尾；C體系色譜柱壓力高，出峰時間滯后，峰形為雙頭峰且響應值低；D體系響應高且對稱性好；E體系響應值低于D體系。因此，試驗選擇0.1%甲酸水溶液-乙腈（以D表示）作為檢測氯苯胍的流動相體系（如圖2所示）。

圖2 不同流動相體系對氯苯胍提取效率的影響

2.3 優化提取溶劑

通過試驗觀察不同提取溶劑的提取效果，在同一提取條件下（添加0.2%甲酸），當提取溶劑中乙腈含量小于60%后提取溶劑渾濁。因此試驗對比含0.2%甲酸的乙睛溶液（用A表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（9∶1，V/V）溶液（用B表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（8∶2，V/V）溶液（用C表示）、含0.2%甲酸的乙睛-水（7∶3，V/V）溶液（用D表示）4種乙腈含量不同的溶劑提取雞蛋和雞肉中的氯苯胍。結果顯示，隨著乙睛含量降低，氯苯胍提取效率先升高后降低，質控樣回收率在60%～99%。用B溶液提取雞蛋和雞肉中的氯苯胍，質控樣的回收率分別能達到97.2%和94.6%，高于其他比例溶液的提取效果。因此試驗選取含0.2%甲酸酸化的乙睛-水（8∶2，V/V）溶液（用C表示）作為最佳提取溶劑（如圖3所示）。

圖3 不同提取溶劑對氯苯胍提取效率的影響

2.4 濾膜材質對試驗結果的影響

通過比較混合纖維素（MCX）微孔濾膜、尼龍（PA）微孔濾膜和聚四氟乙烯（PTFE）疏水性濾膜，這3種不同材質濾膜對同一質量濃度（50.0 ng/mL）氯苯胍溶劑標的吸附差異如圖4所示。裝瓶前同時棄去前5滴液體，取0.5 mL上機測定。結果表明，只有聚四氟乙烯疏水性濾膜損失最少，過濾前后上機濃度差異最小，其余濾膜有較大損失。

圖4 不同材質濾膜過濾效果

2.5 離子色譜圖

按照優化后的質譜條件和色譜條件，對經過前處理后得到的雞蛋和雞肉的空白樣品、質控樣品及基質標進行分析，得到的TIC色譜圖（如圖5和圖6所示）。目標物氯苯胍出峰時間在3.4 min左右，峰形尖銳且對稱，基質中在目標峰前后無干擾。由峰面積數值可得，雞蛋和雞肉質控樣的加標回收率分別是88.5%和91.5%，能滿足檢測的要求。

圖5 雞蛋中氯苯胍TIC譜圖

圖6 雞肉中氯苯胍TIC譜圖

3 方法的評價

3.1 線性范圍和檢出限

通過比較相同濃度下的氯苯胍溶劑標準溶液與空白基質中添加標準溶液峰面積大小，結果發現存在基質抑制效應，故選用空白基質添加標準溶液進行線性范圍的驗證。在優化條件后對一系列氯苯胍基質添加標準溶液進行測定，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標進行回歸分析。結果表明，氯苯胍在1～50 ng/mL范圍內呈現良好的線性關系，雞蛋和雞肉中線性相關系數均為（R2=0.999 4）。在信噪比rSN為3時，計算得出氯苯胍的檢出限為5 μg/kg；在信噪比rSN為10時，計算得出氯苯胍的定量限為10 μg/kg。該方法線性關系良好（見表3）。

表3 雞蛋和雞肉中氯苯胍的線性方程、線性范圍、相關系數

3.2 回收率和精密度

任意選取一份空白雞蛋和雞肉樣品，按照試驗方法進行3個濃度加標測定回收率，對各濃度6個平行樣品進行分析。試驗結果（見表4），雞蛋中氯苯胍的平均回收率為91.3%～94.1%，相對標準偏差為1.6%～3.0%，雞肉中氯苯胍的平均回收率為80.3%～93.8%，相對標準偏差為0.1%～1.8%，說明該方法回收率穩定且精密度良好。

表4 雞蛋和雞肉中氯苯胍的回收率和精密度

3.3 實際樣品的測定

收集新疆地區雞肉和雞蛋樣品共96個，按照優化后試驗條件對雞蛋和雞肉樣品進行測定。結果顯示，所有收集樣品中均未檢出氯苯胍。

4 結論

采用HPLC-MS/MS質譜法分離。通過對儀器條件優化、前處理環節優化（不同流動相、不同提取溶劑等因素），提高雞蛋和雞肉中氯苯胍的提取效率并減少預處理時間。在方法學驗證和實際樣品測定結果中表明，該方法具有分析速度快，經濟成本低的特點，適于雞蛋和雞肉中氯苯胍的定性定量檢測。