液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中5種農藥

陳亮，高海榮，陳碩，王秀云，張聰*，劉億婕*

1. 福建省食品藥品質量檢驗研究院（福州 350000）；2. 福建省藥品審核查驗中心（福州 350000）

茶葉中富含茶多酚類化合物和人體必需的多種微量元素，有利于健康，茶飲料受到世界各國人民的喜愛。然而在茶葉種植過程中，會使用農藥來除草、除蟲、防病等[1-2]，有些農藥甚至會超標[3]，因此農藥殘留成為茶葉質量安全問題之一[4]。2016—2020年，歐盟多次通報茶葉中丁醚脲、唑蟲苯甲酰胺問題[5]，同時我國最新修訂的GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留量》中并未規定茶葉中甲基硫菌靈、氯噻啉、氯蟲苯甲酰胺農藥殘留檢測的標準方法及限量（氯噻啉為臨時限量），因此建立適用于茶葉中丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農藥殘留量的檢測方法非常有必要。

QuEChERS樣品前處理方法于2003年首次被提出[6]，是一種簡便、可靠的前處理技術[7-9]，QuEChERS被廣泛應用于食用農產品中農獸藥殘留的檢測[10-11]。MWCNTs是一種新型材料，由多層石墨化片卷曲而成的碳納米管，其具有比表面積大、表面吸附性能好、選擇性能好等優點。近年來，也有少量報道將MWCNTs用于農藥殘留檢測中[12-13]，為快速高效的檢測茶葉中丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農藥殘留，試驗基于QuEChERS方法，優化N-丙基乙二胺（PSA）、C18、MWCNTs的用量，利用高效液相色譜-串聯質譜法同時分析檢測茶葉中這5種農藥殘留。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試驗儀器

AB 5500 Qtrap三重四極桿質譜儀（美國AB公司）；1290 Infinity安捷倫高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；CR21N落地式高速冷凍離心機（日本日立公司）；Milli-Q超純水處理系統（美國Millipore公司）；XSE204電子分析天平（瑞士梅特勒有限公司）；Turbo Vsp Lv全自動氮吹儀（美國Biotage公司）；HM100刀式研磨機（北京格瑞德曼公司）；MS3型渦旋混合器（德國IKA公司）。

1.1.2 試劑與材料

甲醇、乙腈、丙酮（色譜純，德國默克公司）；醋酸鈉、無水硫酸鎂（分析純，國藥集團化學有限公司）；MWCNTs（內徑3～5 μm，外徑8～15 μm，長度50 μm）、甲酸、醋酸（質譜級）（均為上海阿拉丁化學試劑有限公司）；SelectCoreTMN-丙基乙二胺（PSA）50 μm、SelectCoreTMC1850 μm、陶瓷均質子（長2 cm×外徑1 cm）：納譜分析技術（蘇州）有限公司；丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺對照品（100 μg/mL，天津農業部環境質量監督檢驗測試中心）；Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美國Agilent公司）。

茶葉樣品購自當地超市或市場，空白基質樣品來自購買樣品初篩后確定無丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺殘留的樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

取不少于200 g的茶葉樣品，經刀式研磨器粉碎后，過0.180 mm（80目）的篩后封裝于塑料瓶中，于0～4 ℃保存，準確稱取2.0 g（精確至0.000 1 g）茶葉粉末于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻后，靜置浸泡30 min。加入10 mL酸化乙腈（含1%醋酸，體積比）并混勻，蓋上蓋子后置于冰箱-18 ℃冷卻30 min，加入6 g無水硫酸鎂、1.5 g醋酸鈉及1顆陶瓷均質子，蓋上蓋子，劇烈渦旋振蕩2 min，以8 000 r/min的轉速離心10 min。取5 mL上清液于裝有900 mg無水硫酸鎂、200 mg PSA、200 mg C18及50 mg MWCNTs的15 mL離心管內，振蕩渦旋2 min后，以8 000 r/min的轉速離心10 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，待上機測定。

1.2.2 標準溶液的配制

用乙腈將丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺標準物質配制成1 μg/mL 5種農藥混合標準溶液，于-18 ℃避光保存；根據試驗要求，按照1.2.1的樣品前處理步驟處理空白茶葉樣品制得空白樣品基質，用空白基質溶液配制質量溶度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 ng/mL的5種農藥的混合標準工作溶液。

1.2.3 液相色譜-質譜條件

液相條件：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）。進樣體積2 μL，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃。流動相A為0.1%甲酸水；流動相B為乙腈。液相梯度洗脫：0～1 min，70% A；1～5 min，70%～10% A；5～8 min，10% A；8～9 min，10～70% A；9～11 min，70% A。

質譜條件：離子源采用電噴霧電離正模式（positive electrospray ionizationm，ESI+），離子源溫度450 ℃；氣簾氣壓20 psi；輔助氣壓50 psi；霧化氣壓50 psi；電噴霧電壓4 500 V；碰撞室入口電壓9 V；碰撞室出口電壓15 V。掃描方式采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

將5種農藥標準物質配制成50 ng/mL混合標準溶液，在正離子模式下，采用多反應監測模式，確定5種農藥的母離子、定性離子、定量離子、去簇電壓、碰撞電壓。5種農藥質譜條件參數優化結果見表1。用空白基質配制50 ng/mL 5種農藥的色譜圖見圖1。

表1 5種化合物質譜參數

圖1 空白基質配制50 ng/mL 5種化合物的色譜圖

2.2 提取溶劑的選擇

茶葉樣品的基質復雜，色素含量較多，使用適當的提取溶劑，有利于除去樣品中的雜質，提高檢驗結果的準確性。甲醇、乙腈、酸化乙腈、乙酸乙酯、丙酮是農藥殘留提取過程中常用有機試劑。試驗比較甲醇、乙腈、酸化乙腈（含1%醋酸，V/V）、乙酸乙酯、丙酮作為提取溶劑時對5種農藥殘留的提取效率。試驗發現，使用丙酮、酸化乙腈、乙腈作為提取溶劑時，5種農藥殘留的回收率均較好，但是丙酮提取時樣品的顏色較深，不利于后續的凈化，乙腈對大部分農藥均有較高的溶解性，乙腈作為提取劑提取的雜質較少[14]，在乙腈中加入一定量乙酸，維持溶液pH，可減少待測藥物的降解[15]，因此選用酸化乙腈（含1%醋酸，V/V）作為提取溶劑。

2.3 流動相的選擇

比較甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時對各物質的響應的影響。試驗發現乙腈-0.1%甲酸水作為流動相按照一定比例梯度洗脫的效果最佳，加入微量的酸更有利于各物質的離子化，峰形較好，響應較高，因此流動相選用乙腈-0.1%甲酸水。

2.4 凈化劑的選擇

茶葉中富含咖啡因、茶多酚、有機酸、色素等物質，為有效的除去雜質，以提高檢測的準確性，凈化過程是一個關鍵的步驟。試驗方法采用PSA、C18及MWCNTs作為吸附劑，PSA能有效除去基質中的茶多酚、有機酸等機型雜質[16]，C18能有效除去基質中的色素、維生素等非極性物質[17]，MWCNTs能有效去除色素和平面結構等干擾物質[18]。試驗以空白樣品中加入50 μg/kg 5種農藥混標，制備6個平行樣，按照1.2.1的方法制備樣品，上機測定回收率，采用正交試驗L9(34)確定PSA、C18及MWCNTs的最佳使用量。由正交試驗結果可以看出，各組試驗的回收率在60.8%～89.0%之間，丁醚脲、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺中C18對其回收率的影響最大，PSA次之，MWCNTs的影響最小；甲基硫菌靈、氯噻啉中C18對其回收率的影響最大，MWCNTs次之，PSA的影響最小。丁醚脲、甲基硫菌靈、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺對PSA、C18、MWCNTs的最佳用量均分別是200，200和50 mg，氯噻啉對PSA、C18、MWCNTs的最佳用量分別是200，200和100 mg，氯噻啉對MWCNTs使用量的K2、K3值比較接近，綜合考慮，試驗PSA、C18、MWCNTs的最佳用量均分別是200，200和50 mg。具體結果見表2和表3。

表2 正交試驗設計及結果

表3 正交試驗結果分析

2.5 基質效應

在檢測農藥殘留時基質效應對結果的準確性和重復性影響較大。基質效應主要是在前處理過程或樣品本身引入的雜質干擾導致目標化合物的信號減弱和增強。方法采用相對響應強度的比值來評價基質效應的強弱，即ME=B/A，A表示分析物在純溶劑的響應值，B表示分析物在空白基質中的響應強度。ME小于0.9為基質效應減弱，大于1.2為基質效應增強[19]。方法分別以空白茶葉提取液與乙腈溶劑配制50 ng/mL 5種農藥混標以考察樣品的基質效應，結果表明5種農藥的ME值為0.613～0.825，均為基質減弱效應，因此采用基質配標消除基質效應對測定結果的影響。

2.6 方法的標準曲線、檢出限和定量限

用空白茶葉基質溶液配制質量溶度為0.1，0.5，1.0，5.0，10.0，20.0和50.0 ng/mL的5種農藥的混合標準工作溶液，采用外標法定量，5種農藥在0.1～50 ng/mL線性關系良好，具體結果見表3。

對空白茶葉基質添加5種農藥混合標準品，用空白基質提取液逐級稀釋，以3倍信噪比（rSN）和10倍信噪比（rSN）分別作為方法的檢出限（limit of detection，SLOD）和定量限（limit of quantification，SLOQ），具體結果見表4。

表4 5種農藥的線性方程、檢出限及定量限

2.7 回收率和精密度

在空白茶葉樣品中添加適量的5種農藥標準溶液，每個加標濃度制備6個平行樣，5種農藥的平均回收率為81.0%～97.6%，相對標準偏差（relative standard deviation，SRSD）在5.6%～9.9%，滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》對回收率和相對標準偏差的要求，表明該方法能夠滿足丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農藥的檢測，具體結果見表5。

表5 5種農藥的回收率和相對標準偏差

2.8 實際樣品的測定

以試驗建立的方法對市售151批茶葉進行檢測，其中：丁醚脲檢出24批次，檢出率為15.9%，其值為0.001 3～2.224 9 mg/kg；甲基硫菌靈檢出9批次，檢出率為6.0%，其值為0.004 3～0.073 6 mg/kg；氯噻啉均未檢出，檢出率為0；唑蟲酰胺檢出127批次，檢出率為84.1%，其值為0.001 2～0.670 8 mg/kg；氯蟲苯甲酰胺檢出27批次，檢出率為17.9%，其值為0.000 8～0.028 3 mg/kg。丁醚脲、氯噻啉、唑蟲酰胺檢出值均在GB 2763—2021中規定的限值范圍內，甲基硫菌靈、氯蟲苯甲酰胺在GB 2763—2021中均未規定限量值，但均有一定程度檢出，說明有部分茶農在茶葉種植過程中使用甲基硫菌靈、氯蟲苯甲酰胺，因此存在著一定風險。

3 結論

試驗采用多壁碳納米管/QuEChERS凈化方法與高效液相色譜-串聯質譜法相結合，建立茶葉中丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農藥殘留的檢測方法。研究表明，該方法的相關系數為0.997 1～0.999 6，檢出限在0.5～5 μg/kg；在茶葉空白基質中進行加標試驗，平均回收率為81.0%～97.6%，SRSD為5.6%～9.9%。該方法操作簡單、靈敏度高、重現性好、準確可靠，能夠滿足日常檢測要求，可為國內食品監管部門監測茶葉中丁醚脲、甲基硫菌靈、氯噻啉、唑蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺5種農藥殘留提供一種可行的參考方法和理論支持。