microRNA-335-5p通過靶向WISP3對軟骨細胞產(chǎn)生影響

黃殿華 李煜 陳順有 潘源城 林然 盧育南

（廈門大學附屬福州第二醫(yī)院，福建醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院，福建醫(yī)科福建省創(chuàng)傷骨科急救與康復臨床醫(yī)學研究中心，福州市創(chuàng)傷醫(yī)學中心，福州 350007）

骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種最常見的肌肉骨骼疾病，具有復雜、多因素的特點，主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨的退化、骨贅形成、滑膜炎癥和其他關節(jié)組織的病理改變[1-2]。研究表明，microRNAs（miRNAs，miRs）能夠通過靶向成骨負性調節(jié)因子或靶向成骨因子來調節(jié)骨形成[3]。microRNA-335-5p作為一種重要的microRNA被廣泛應用于各種細胞過程中，不僅在腫瘤細胞分化、增殖、凋亡、遷移和侵襲等起關鍵作用，其也已被許多研究報道能夠調節(jié)骨髓間充質干細胞的成骨和軟骨形成及分化[4-6]。與正常軟骨相比，在OA患者的軟骨中microRNA-335-5p表達顯著上調[7]。有研究報道，WISP3（Wnt1誘導信號通路蛋白-3，CCN6）作為人出生后正常的骨骼生長和軟骨穩(wěn)定是必不可少的基因之一[8-9]。其能夠促進軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白（Collagen Ⅱ）和蛋白多糖（Aggrecan，ACAN）的表達，并調節(jié)基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的表達[10-12]。而在OA發(fā)病過程中，細胞外基質中CollagenⅡ及ACAN的含量減少，在我們先前研究中已證實在microRNA-335-5p過表達抑制軟骨細胞中CollagenⅡ及ACAN的mRNA表達及蛋白含量且促進MMP13的mRNA表達及蛋白含量。但microRNA-335-5p與WISP3之間的相關性仍未明確。本研究通過過表達和抑制microRNA-335-5p，并進行一系列體外實驗，多角度地闡明microRNA-335-5p在軟骨細胞中的作用機制及其與WISP3之間的關系，為OA新的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠軟骨細胞購自于賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。

1.2 試劑

1.2.1 質粒 microRNA-335-5p mimics、mimics NC、inhibitor及inhibitor NC質粒購自上海吉瑪（Sigma）公司。見表1。

表1 microRNA-335-5p mimics、mimics NC、inhibitor及inhibitor NC質粒序列

1.2.2 實驗試劑 胎牛血清（Gibco，USA）；DMEM低糖培養(yǎng)基（Hyclone，USA）；青霉素-鏈霉素溶液（Hyclone，USA）；Ⅱ型膠原酶（Roche，Switzerland）；胰蛋白酶（Roche，Switzerland）；lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）；microRNA快速提取試劑盒（Aidlab，CHINA）；MiRNA RT/qPCR Detection Kit（Aidlab，CHINA）；逆轉錄試劑盒（Vazyme，CHINA）；SYBR Green Master試劑盒（Vazyme，CHINA）；U6、microRNA-335-5p、GAPDH、WISP3引物（Sigma，CHINA）；RIPA buffer（Boster，USA）；5×loading buffer（Boster，USA）；Western封閉液（Boster，USA）；WISP3一抗（Abcam，UK）；β-actin一抗（proteintech，USA）；二抗（proteintech，USA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 軟骨細胞的培養(yǎng)與處理 小鼠軟骨細胞細胞用含10%胎牛血清的iCell原代軟骨細胞基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，之后2～3 d換液1次。待細胞生長匯合度至培養(yǎng)瓶的90%時按1∶（2～3）進行傳代。

1.3.2 miR-335-5p轉染 轉染前將細胞接種至6孔板，待細胞長到70%～90%，根據(jù)lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）說明書將microRNA-335-5p mimics、mimics NC、inhibitor及inhibitor NC質粒分別轉染至軟骨細胞。轉染前一天更換不含雙抗的培養(yǎng)基，轉染6 h后換液，通過熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)及綠色熒光蛋白的表達，估算轉染效率。

1.3.3 RNA提取及qRT-PCR 轉染后24 h，用microRNA快速提取試劑盒（Aidlab，CHINA）從各組軟骨細胞中提取miRNA，MiRNA RT/qPCR Detection Kit（Aidlab，CHINA）進行逆轉錄，上機分析miRNA的表達，逆轉錄條件為：42 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s。Trizol法提取各組總RNA，按逆轉錄試劑盒（Vazyme，CHINA）說明書逆轉錄獲得cDNA，逆轉錄條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min。根據(jù)SYBR Green Master試劑盒（Vazyme，CHINA）說明書進行加樣操作，并上機分析WISP3的表達。采用2－ΔΔCt法分析實驗結果。U6和GAPDH分別用作miRNA和mRNA檢測的內參。各引物序列見表2。

表2 GAPDH、WISP3、U6、microRNA-335-5p引物序列

1.3.4 Western Blotting 轉染48 h后，使用RIPA buffer（Boster，USA）提取各組軟骨細胞的蛋白，BCA法測定蛋白濃度，將各組蛋白樣品加入其體積1/4的loading buffer（Boster，USA），100 ℃金屬浴變性5 min。以30 μg蛋白量上樣行8% SDS-PAGE分離蛋白，分離條件：20 V 20 min，80 V 30 min，120 V 60 min。半干轉法進行轉膜。用western封閉液（Boster，USA）封閉1.5 h，WISP3、β-actin一抗4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h。TBST漂洗3次，每次10 min，通過經(jīng)典電化學發(fā)光法（ECL）顯影目的蛋白。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。兩組間采用兩獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染效率 轉染6 h后熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及熒光蛋白的表達，轉染效率達80%（圖1）。轉染后24 h，提取miRNA，檢測microRNA-335-5p的表達，結果顯示：mimics組高于mimics NC組，inhibitor組低于inhibitor NC組（圖2），表示轉染成功。

圖1 miR-335-5p轉染6 h后，熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)及熒光強度觀察，轉染率約為80%

圖2 各轉染組中miR-335-5p表達水平變化

2.2 microRNA-335-5p對WISP3的mRNA表達的調節(jié)作用 轉染24 h后，mRNA的檢測結果顯示：microRNA-335-5p過表達顯著下調了WISP3的mRNA表達水平，相反，microRNA-335-5p低表達顯著上調WISP3的mRNA表達水平（圖3）。表明microRNA-335-5p能夠抑制WISP3的mRNA合成（P＜0.05）。

圖3 qRT-PCR檢測各組轉染miR-335-5p mimcs和inhibitor對WISP3的mRNA表達水平的影響

2.3 microRNA-335-5p對WISP3蛋白表達的調節(jié)作用 轉染48 h后，收集細胞，Western Blotting檢測各組WISP3蛋白的表達水平。結果顯示：microRNA-335-5p過表達顯著下調了WISP3的蛋白表達水平，mimics組的蛋白表達量為mimics NC組0.87倍。相反，microRNA-335-5p低表達顯著上調WISP3的蛋白表達水平，inhibitor組的蛋白表達量為inhibitor NC組的1.32倍（P＜0.05）（圖4）。表明microRNA-335-5p能夠抑制WISP3的蛋白合成。

3 討論

microRNAs是一種小的非編碼RNA分子，長19～23個核苷酸[7]。通過完全互補或不完全堿基對結合到同源信使RNA（MRNAs）的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR），從而抑制翻譯或降低穩(wěn)定性，可以直接抑制靶基因的表達，在基因表達的轉錄和轉錄后調控中起著重要作用[13-14]。高度特異的miRNA表達模式與發(fā)育和心血管疾病以及組織的改變等疾病有關，其基因調控在細胞的基本功能、軟骨和骨的發(fā)育中起著重要的作用，被證明是人類癌癥的預后和診斷生物標志物[1,15]。microRNA-335-5p作為microRNAs中的一員，在腫瘤細胞分化、增殖、凋亡、遷移和侵襲等起關鍵作用，在多種實體腫瘤中有差異性表達，也被許多研究報道能夠調節(jié)骨髓間充質干細胞的成骨和軟骨形成及分化[13,16]。Zhang等[17]在小鼠的成骨細胞中過表達microRNA-335-5p，表明microRNA-335-5p在成骨細胞系中的過表達誘導了小鼠成骨分化和骨形成。Kopańska等[7]指出在OA患者的軟骨組織中microRNA-335-5p表達明顯增高。在我們先前研究中已證實在microRNA-335-5p過表達軟骨細胞中CollagenⅡ及ACAN的mRNA表達及蛋白含量均受到抑制，且促進MMP13的mRNA表達及蛋白含量。但關于其對軟骨細胞及成骨細胞的作用機制仍然不明確。何偉珍等[18]指出microRNA-335-5p通過直接靶向DKK1的3'-UTR抑制DKK1表達及調節(jié)Wnt信號通絡，調節(jié)成骨分化。也有研究指出microRNA-335-5p具有靶向和調節(jié)Osterix和RUNX 2在骨中的作用，從而誘導成骨細胞的分化和骨形成[3,19]。

WISP3屬于CCN家族，是一種分泌的富含半胱氨酸的高度保守的基質細胞蛋白（36.9kDa），位于第6q21-22染色體上，既能在細胞內發(fā)揮作用，又能在細胞外發(fā)揮作用，參與多種發(fā)育效應的調控[20-22]。此外，CCN蛋白還參與細胞增殖、遷移、傷口愈合、血管生成和腫瘤發(fā)生等基本生物學過程。近年來，WISP3已被報道在乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、胃癌等癌癥中都有不同程度的表達[23-25]。與WISP3突變相關的疾病研究表明，WISP3是骨骼生長和保持軟骨完整性所必需的基因[9,26]。Liu等[27]通過促進WISP3突變譜的進一步擴展，論證了WISP3基因突變與脊椎骨骺遲緩性發(fā)育不良伴進行性關節(jié)?。⊿EDT-PA）之間的相關性。研究表明，在進行性假性類風濕發(fā)育不良癥（PPD）中，WISP3基因存在純合子核苷酸缺失，其與軟骨丟失和骨骼發(fā)育受限有關[28-29]。WISP3主要通過調節(jié)Collagen Ⅱ的表達來維持軟骨完整性，其能上調人軟骨細胞Collagen Ⅱ及ACAN的表達，并抑制IGF-IR、IRS-1和ERK激酶的活化，表明WISP3可能是一種促進軟骨合成途徑的潛在刺激因子。

microRNA-335-5p及WISP3對軟骨細胞形態(tài)改變均有影響，但是目前沒有文獻報道二者之間是否具有相關性。鑒于OA患者關節(jié)軟骨的嚴重變性以及microRNA-335-5p和WISP3對軟骨細胞中Collagen Ⅱ及ACAN表達的不同影響，我們認為microRNA-335-5p可能通過調節(jié)WISP3的表達進而影響Collagen Ⅱ及ACAN表達，最終導致OA的形成。我們通過將microRNA-335-5p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC分別轉染至軟骨細胞，利用qRT-PCR和Western Blotting分別檢測各組WISP3的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)microRNA-335-5p能夠抑制WISP3的mRNA轉錄及蛋白合成，而WISP3能夠促進軟骨細胞中Collagen Ⅱ及ACAN的表達，是保持軟骨完整性所必需的蛋白。因此我們認為microRNA-335-5p可能通過抑制WISP3的表達來抑制軟骨細胞外基質中CollagenⅡ及ACAN的合成，從而導致軟骨再生障礙，最終導致OA的發(fā)生及發(fā)展。

總之，我們研究表明microRNA-335-5p能夠抑制軟骨細胞中WISP3的mRNA轉錄及蛋白合成，破壞了軟骨的完整性。因此microRNA-335-5p與OA發(fā)展具有相關性，對其有潛在的推進作用。為OA的治療提供了新的靶點和研究方向。但microRNA-335-5p是否直接靶向調節(jié)WISP3，進而影響軟骨細胞外基質中Collagen Ⅱ及ACAN的表達，將是我們接下來研究的重點。