HPLC法同時測定小兒感冒顆粒中綠原酸和連翹苷的含量

張 佩

小兒感冒顆粒為臨床常用的中成藥，含有廣藿香、菊花、連翹、大青葉、板藍根、薄荷等10種中藥成分，主要用于治療小兒風熱感冒，具有清熱解毒、消腫止痛的作用[1]。連翹與廣藿香為君藥，菊花、大青葉、板藍根等為臣藥，共同發揮療效。 綠原酸為菊花的主要活性成分，具有抗病毒、抗氧化、抑菌、消炎等多種功效，連翹苷為連翹的主要活性成分，具有良好的抗病毒作用[2]。2020版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)[3]質量標準中，除常規檢查外，僅對大青葉和板藍根中的靛藍進行了鑒別，尚缺少對小兒感冒顆粒中有效成分的含量的控制。在藥品生產過程中各廠家質量控制標準不同，進而質量存在一定差異，治療效果也不一致。

高效液相色譜法(HPLC)為通過溶質在固定相和流動相之間進行連續多次交換而實現分離的技術，廣泛應用于藥品檢測過程中[4]。為進一步控制小兒感冒顆粒品質，本次研究中建立了同時測定小兒感冒顆粒中綠原酸和連翹苷的含量的HPLC檢測方法，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Agilent ZORBAX SB- C18 色譜柱 (安捷倫科技有限公司)； H2OPRO-VF-T純水機(賽多利斯公司)；JP-100ST超聲波清洗儀(深圳市潔盟清洗設備有限公司)；ME155DU/02電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；RV10旋轉蒸發儀(德國IKA公司)；Eppendorf Research Plus 手動移液器(德國艾本德股份公司)；濾膜(Xiboshi syringe filter)。

1.2 藥品 試劑及對照品小兒感冒顆粒(市售同廠家同批次)；乙腈(默克股份兩合公司)；甲醇(默克股份兩合公司)；磷酸( Fluka有限公司)；乙腈、磷酸均為色譜純，其他試劑為分析純。綠原酸對照品(110753-201817,含量以96.8%計)、連翹苷對照品(110821-201615,含量以94.9%計)。

2 方法及結果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：流動相A為100%乙腈，流動相B為0.2%磷酸水溶液。進行梯度洗脫，洗脫程序。采用雙波長檢測，檢測波長326 nm測定綠原酸含量，230 nm下測定連翹苷含量， 流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進樣量為10 μl。見表1。

表1 洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液精確稱取綠原酸對照品5.31 mg、連翹苷對照品5.02 mg倒入25 ml棕色量瓶中，甲醇定容，搖勻，精密吸取5～10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，用微孔濾膜過濾，即為混合對照溶液。

2.2.2 供試品溶液取小兒感冒顆粒內容物研細，精密稱取5.00 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取甲醇50 ml加入錐形瓶，并稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再次稱重，加甲醇補足重量，濾過，精密量取濾液25 ml，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜過濾，即為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液按照《中國藥典》[3]中小兒感冒顆粒標準中規定的處方工藝，制成不含菊花、連翹的陰性樣品，精密稱取5.00 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取甲醇50 ml加入錐形瓶，并稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再次稱重，加甲醇補足重量，濾過，精密量取濾液25 ml，蒸干，殘渣加甲醇溶解，并轉移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜過濾既得。

2.3 系統適用性測試取陰性溶液、供試品及對照品溶液各10 μl進樣。結果顯示供試品色譜峰分離度良好，綠原酸及連翹苷理論塔板數不低于5000，峰與峰之間分離度大于1.5，系統適用性較好。見表2。

表2 系統適用性

2.4 線性關系精密吸取綠原酸、連翹苷的混合溶液2.0 μl、4.0 μl、6.0 μl、8.0 μl、10.0 μl、12 μl進樣，計算，綠原酸和連翹苷的回歸方程為Y=49.61X-9.153，r=0.999，Y=11.04X-1.801，r=0.999，線性關系良好。綠原酸、連翹苷分別在0.21～1.23 μg、0.19～1.14 μg范圍內呈良好的線性關系。見表3。

表3 綠原酸 連翹苷的回歸方程及線性范圍

2.5 精密度實驗取綠原酸和連翹苷的混合對照，連續5次進樣，計算，綠原酸和連翹苷峰面積RSD分別為0.26%、0.17%，綠原酸和連翹苷峰保留時間RSD分別為0.42%、0.75%，說明本次測試精密度良好，符合要求。

2.6 重復性實驗取小兒感冒顆粒6份，按照2.3的操作方法進行操作，進樣測定，計算綠原酸和連翹苷含量，計算RSD值，RSD分別為 1.3%、1.0%，說明該方法下測量小兒感冒顆粒含量具有良好的重復性。

2.7 穩定性實驗取供試品溶液1份，在12 h內重復實驗6次，記錄并分析綠原酸和連翹苷的峰面積，RSD分別為0.62%、0.59%，說明該方法下測量小兒感冒顆粒含量具有良好的穩定性。

2.8 加樣回收率精密稱取供試品約2.5 g，共9份，加入對照品溶液后混勻，按2.3操作方法制備供試品溶液，進樣。綠原酸、連翹苷的加樣回收率分別為97.9%、98.5%，RSD分別為1.92%、1.11%。見表4、表5。

表4 小兒感冒顆粒中綠原酸的加樣回收率

表5 小兒感冒顆粒中連翹苷的加樣回收率

2.9 綠原酸和連翹苷含量小兒感冒顆粒中綠原酸的含量為 0.076 mg/g，連翹苷含量為0.093 mg/g。

3 討論

小兒感冒顆粒為兒科臨床常用的藥物，含有多種中藥成分，具有清熱瀉火，消炎止痛功效，療效確切，且毒副作用小，常用于小兒感冒的治療中[5，6]。綠原酸、連翹苷為小兒感冒顆粒中重要的生物活性成分，其中綠原酸具有抗菌、抗病毒、興奮中樞等藥理作用，臨床研究表明不同廠家藥品效果不一致，即使同一廠家不同批次藥物組成成分也存在一定的差異[7]。2020版《中國藥典》[3]中僅采用薄層色譜法鑒別小兒感冒顆粒的成分，尚未涉及對小兒感冒顆粒有效成分的測定。對小兒感冒顆粒的控制不夠嚴格，加強對小兒感冒顆粒品質的控制具有重要的臨床意義。

隨著色譜技術的發展及應用，HPLC法被用于中藥質量的控制當中[8]，以液體為流動相，通過各組分在流動相極性不同，實現了不同組分的分離，能夠有效地對中藥組成進行定性、定量分析，評估藥品質量。相關研究指出HPLC法在小兒感冒顆粒的檢測中靈敏度高，準確度高，且所需樣本量較少，能夠有效地對小兒感冒顆粒中的各組分進行檢測，有助于藥品的質量控制[9，10]。

在本次研究中建立了 HPLC同時測定小兒感冒顆粒中綠原酸和連翹苷的含量的方法。在如下色譜條件下，色譜柱：Agilent ZORBAX SB- C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脫，檢測波長326 nm測定綠原酸含量，230 nm下測定連翹苷含量， 流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進樣量為10 μl，實現了綠原酸和連翹苷含量的同時測定，節約了時間及檢測成本，且該檢測方式精密性高，重復性好，穩定性符合要求，對小兒感冒顆粒質量的檢測具有重要意義。

綜上所述，該檢測方式簡單、快速、有效，可用于小兒感冒顆粒的質量控制，對臨床安全用藥具有重要的意義，值得推廣使用。