訶子對大鼠血清代謝產物的影響研究*

畢力格，烏日漢，麗 麗，陳玉花，孟香花，寶樂爾，韓曉靜，肖田梅，白梅榮

(內蒙古民族大學，內蒙古 通遼 028000)

訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.或絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.var.tomentella Kurt.的干燥成熟果實。秋、冬二季果實成熟時采收。蒙古名為阿茹日，異名為額莫音·芒來、浩日音·達日嘎，味澀，性平，具有調節赫依、希日、巴達干失調，解毒，調元等功能。主治赫依病，希日病，巴達干病，赫依、希日、巴達干合并癥和聚合癥，各種毒癥等[1]。現代研究證明，訶子還有止瀉、收斂降火、利咽等功效，主治瀉久痢、便血脫肛、肺虛喘咳、咽痛、音啞等癥狀[2-3]。在蒙藥藥性理論的指導下，訶子主要用與中毒解救和調元，在98%的常用含有毒藥味的蒙藥復方中訶子均發揮著解毒和調元作用，兩千多年的蒙醫臨床實踐也證明了復方組成的合理性和可行性。因此，訶子被譽為“藥中之王”和“鎮毒之王”的美名。目前對訶子的研究主要集中于訶子化學成分、現代藥理作用及基于代謝組學的腦損傷保護機制及草烏解毒機制等研究，但未見訶子單味藥代謝組學的研究報道。因此，本研究用LC-MS技術，分析蒙藥訶子對大鼠小分子代謝物的改變情況，為探討訶子調節赫依、希日、巴達干失調，解毒和調元功效的現代化機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠，SPF級，體重為(200±20)g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供(SCXK(遼)2015-0001)。

1.2 藥品與試劑 實驗用訶子藥材是使君子科植物訶子成熟果實，由內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供，由蒙醫藥學院包桂花教授鑒定；純化水(屈臣氏集團有限公司)，質譜乙腈(美國Thermo Fisher Scientific公司)，甲酸(Sigma-Aldrich公司)。

1.3 儀器 質譜儀MASS(TripleTOF5600+，AB SCIEXTM)；臺式高速冷凍離心機(Mikro 220R，Hettich)；羅氏全自動生化分析儀(cobas c 311)；移液器(Eppendorf N13462C，德國Eppendorf公司)；粉碎研磨儀(TL-48R，上海萬柏生物科技有限公司)；漩渦振蕩器(QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；色譜UHPLC(Nexera UHPLC LC-30A，島津SHIMADZU)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及取材 取雄性大鼠16只，按體重隨機分為正常組、給藥組訶子1.2857 g/kg(臨床等效量)、每組8只。從實驗第1 d開始，給藥組灌胃相應的藥物溶液，每日1次，連續21d給藥，正常組灌胃等量生理鹽水。末次給藥后，經 2% 戊巴比妥鈉(50 mg· kg-1)腹腔注射麻醉，采用腹主動脈取血，在室溫下 靜置半小時后放入3 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，同時采集同一部位肝、腎組織置凍存管，置于-80 ℃ 冰箱中保存待測。

1.4.2 代謝物提取 血清樣本于4℃解凍后，取100 μL加入300 μL甲醇，震蕩提取于12000 rpm，4℃下離心10 min，取上清液進樣10 μL，用UPLC-MS檢測。

1.4.3 UPLC-MS檢測 采用Waters BEH HILIC 色譜柱(100×2.1 mm，1.7 μm)。流動相A(0.1%甲酸水，乙酸銨)和B(乙腈)，柱溫35℃，流速0.3 mL/min，進樣量10 μL。洗脫梯度：95%～50% B，0～16 min；50% B，16～20 min；50%～95% B，20～21 min；95% B，21～22.5 min。

質譜參數條件：采用電噴霧電離(ESI)正離子和負離子模式進行檢測。ESI源條件如下：離子源 Gas1：50，離子源 Gas2：50，氣簾氣壓力(CUR)：25，界面加熱溫度：500℃(正離子)和450℃(負離子)，離子噴霧電壓浮動(ISVF)5500 V(正離子)和4400 V(負離子)，TOF質量掃描范圍：100～1200 Da，產物離子掃描范圍：50～1000 Da，TOF MS 掃描累積時間0.2 s，產物離子掃描累積時間0.01 s，二級質譜采用information dependent acquisition(IDA)獲得，并采用high sensitivity模式，去簇電壓(DP)：±60 V，碰撞能量：35±15 eV。

1.4.4 數據處理 應用SPSS 22.0進行統計分析。采用t檢驗、秩和檢驗、單因素方差分析分別進行組間比較。以P<0.05為差異有統計學意義。

利用Analysis Base File Converter軟件將獲得的原始數據轉換成ABF格式，再導入MS-DIAL 4.10軟件進行預處理。使用MassBank，Respect，GNPS數據庫進行比對。分析各組血清樣本采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘-判別分析法(OPLS-DA)。篩選VIP≥1及FC>=1.5和P<=0.05作為差異代謝物。再使用MetaboAnalyst 4.0分析代謝通路。

2 結果

2.1 PCA分析結果 PCA通過主要新變量對各組數據進行歸類，去除重復性差和異常樣本，可觀察樣品的聚集、離散程度。如圖1、所示，正常組(8)與訶子組(7)的大鼠肝代謝物呈現分離趨勢，說明代謝物具有一定的差異。利用MetaboAnalyst軟件進行聚類分析，以熱圖的聚類結果分析組間差異，顏色深淺表示代謝物水平，紅色為升高、藍色為降低。如圖2所示，正常組與訶子組的代謝物相對豐度呈有明顯差異。表明，訶子可使大鼠腎代謝物產生一定變化。

圖1 血清代謝物 PCA

圖2 血清代謝物熱圖

2.2 OPLS-DA結果 OPLS-DA作為一種有監督的分析方法，能夠篩選出差異代謝物。如圖3所示，正常組大鼠血清代謝物與訶子組完全分離，說明代謝物譜有顯著差異。通過參數檢驗進行OPLS-DA 模型驗證，具有良好的準確率和預測率(參數R2Y和Q2均大于0.5)。

圖3 血清OPLS-DA的S-plot圖

2.3 差異代謝物的篩選 血清差異代謝物的篩選：為尋找潛在差異代謝物，采用OPLS-DA中VIP≥1和P<0.05，且fold change>1.5(或<0.5)的標準篩選，通過MassBank，Respect，GNPS數據庫進行檢索分析。訶子組血清樣本中篩出2個差異代謝物。與正常組比較，訶子組谷氨酰胺、溶血性磷脂酰膽堿明顯上升，見表1。

表1 血清差異代謝物鑒定

2.4 差異代謝物通路分析 將篩選出的差異代謝物導入MBRole 2.0進行通路富集分析。血清差異代謝物涉及ABC轉運蛋白、嘧啶代謝、氨基酸的生物合成、嘌呤代謝等通路，見圖4。

圖4 血清樣品代謝通路氣泡圖

3 討論

從血清OPLS-DA的S-plot圖中能看出，給藥組和正常組數據點能分開，不重疊，通過血清差異代謝物的篩選發現供能物質谷氨酰胺、溶血磷脂酰膽堿含量明顯增高。

谷氨酰胺主要在大腦組織中生成，骨骼肌，心肌等。是體內解除氨毒的重要方式，體內谷氨酰胺合成給蛋白質提供重要原料[3]；體內儲存的氨、經過血液運輸至肝轉運利用、進一步到腎及小腸等組織中代謝。是合成嘌呤、嘧啶等含氮化合物的重要原料，改善心臟功能，緩解急性心肌梗死癥狀[4]。本實驗結果表明，訶子可提高機體解除氨毒功能，并對改善心臟功能及急性心肌梗死等方面也有一定的促進作用。

溶血磷脂酰膽堿(LPC18：2)是磷脂的一種，具有多種生理功能，與糖尿病、動脈粥樣硬化、血脂異常等代謝性疾病和心血管疾病密切相關。LPC18∶2主要在肝臟代謝，在肝臟疾病和藥物引起的肝毒性血清中LPC 16∶0、LPC18∶0、LPC18∶2、LPC 18∶3或LPC18∶1等多種LPCs的濃度均明顯降低[5-9]。大量研究推測，LPC18∶2將能成為肝臟疾病和肝毒性損傷的生物標志物，將對肝臟疾病和藥物肝毒性的診斷與治療發揮重要作用。另外，較高水平的 LPC18∶2反映其機體血漿脂質的轉運能力。LPC18∶2含量下降可抑制外周游離膽固醇的酯化，被載脂蛋白攜帶最終轉運回肝臟代謝等脂質轉運能力受限，增加其血漿膽固醇含量，使肝臟功能受損進而其脂肪變性[10-13]。本研究結果顯示，LPC18∶2含量的提高，可防止肝臟脂肪變性、肝硬化、酒精性肝損傷、非酒精性肝損傷等病理變化。同時可推測訶子對多種代謝性疾病和心血管疾病均有一定的保護作用。該實驗結果與訶子在蒙藥藥性理論指導下所產生的廣泛解毒和調元作用相符合。訶子被譽為“藥中之王”、“鎮毒之王”美名具有一定的科學性和合理性。因此，訶子在含有毒蒙藥復方發揮其神奇臨床療效中具有重要的不可替代的角色。