天津地區豬塞內卡病毒病流行病學調查

張 穎 孫冬冬 趙 靜 周永燚 袁雪濤 王芳霞 哈子明

（1.天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402； 2.濱海新區農業農村發展服務中心，天津 300480）

豬塞內卡病毒病是由A型塞內卡病毒（Senecavirus A，SVA）引起的一種以鼻鏡、蹄部冠狀帶處出現水泡、潰爛創面等特征的動物傳染病，不同年齡階段的豬均易感。病豬臨床癥狀與口蹄疫、豬水泡病、水泡性口炎相似而常被忽略，目前該病沒有商品化疫苗，制約養豬業的健康發展，造成養豬業的經濟損失，因此近幾年備受關注。本研究通過對天津地區豬群塞內卡病毒病流行病學調查，為進一步研究提供有力的數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2021年3～9月采自天津市寶坻區、寧河區、西青區等區域3個大型屠宰場和寧河、寶坻2個無害化處理場的樣品，其中血清樣本共計839份，全血采集后，盡快分離血清，-20℃冷凍保存，備用。組織、口腔棉拭子樣本共計404份，將采集的口腔/泄殖腔棉拭子放入含1ml生理鹽水的無菌EP管中，組織放入采樣袋中，編號后冷藏備用具體信息如下（表1、表2）。

表1 血清樣本統計

表2 組織病料樣本統計

1.2 主要試劑和耗材

微量加樣器thermo；加液槽；去離子水；電熱恒溫培養箱DNP-9052AE；全自動洗板機Thermo；酶標分析儀Sunshine；吸水紙；塞內卡病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒購自蘭州獸醫研究所。生物安全柜Haier；離心機Thermo；實時定量熒光PCR儀QuanStdio 6 Flex；SimlyP病毒DNA/RNA共提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；塞內卡病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒購自達安科技；PBS溶液現用現配。

1.3 血清學檢測方法

1.3.1 洗滌液的準備

使用前濃縮洗滌液用去離子水25倍稀釋，可在2～8℃條件下保存7d。

1.3.2 樣品的準備

用樣品稀釋液30倍稀釋待檢樣品。每個樣品在添加到反應板前應混勻。注意：不要稀釋陰陽性對照。取樣后需更換吸頭。

1.3.3 血清抗體檢測

按照塞內卡病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒說明書的要求進行操作。

1.3.4 結果判定

當S/P 0.4判定結果為陰性；當 S/P≥0.4判定結果為陽性。

1.4 病原學檢測方法

1.4.1 樣本處理

利用無菌鑷夾取待檢病死或屠宰豬的脾臟、肺臟、淋巴結、腎臟等組織2.0g于研磨器中充分研磨，加入PBS 10ml充分研磨混勻，將組織懸液轉入1.5ml無菌離心管中3000rpm離心10min，離心取上清液轉入Eppendoff管中，編號備用。鼻拭子、肛拭子放入盛有1.0ml PBS 的Eppendoff管中，編號備用。

1.4.2 病毒核酸的提取

參照SimlyP病毒DNA/RNA共提取試劑盒說明書進行操作。

1.4.3 病原學檢測

按照A型塞內卡病毒核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）說明書進行操作。取N個（N=待測樣本個數+陰性質控品+SVA陽性質控品）PCR反應管。按照以下擴增體系進行配置：

質量控制：

（1）陰性質控品：FAM檢測通道無明顯擴增曲線。

（2）陽性質控品：FAM檢測通道有明顯擴增曲線，且Ct值≤32

同時滿足以上要求，實驗成立。

（3）結果判定

若檢測樣品FAM通道無擴增曲線或Ct值＞38，判定樣品為A型塞內卡病毒陰性；

若檢測樣品FAM通道無擴增曲線且Ct值≤38，判定樣品為A型塞內卡病毒陽性。

2 結果與分析

2.1 SVA血清學檢測結果

血清學共檢測樣本839份，結果顯示：天津地區3個屠宰場SVA血清樣本陽性樣本數為0，抗體陽性率為0%（表3）。

表3 血清學檢測結果

2.2 SVA病原學檢測結果

病原學共檢測樣本404份，結果顯示：天津地區3個屠宰場、2個無害化處理場SVA病料樣本陽性樣本數為0，陽性樣本率為0%（表4）。

3 討論

單純使熒光定量RT-PCR方法檢測豬塞內卡病毒，只能通過檢測病毒核酸來直接檢測病毒，這對正處于病毒感染階段且體內具有一定病毒含量的個體是易于檢出的，但對感染過程已經結束或者感染雖然持續存在但體內病毒含量很低的個體則難以檢出，而抗體檢測則可以解決這個難題，故兩種方法聯合使用無疑會使檢測結果更加全面和準確。

本研究采用SVA血清學和病原學方法，對天津地區部分屠宰場和無害化處理場采集的血清樣本、組織樣本進行檢測，結果顯示，血清樣本和組織樣本中均未檢出SVA陽性。高春柳[1]等利用實時熒光定量RT-PCR和ELISA方法，對華東、華南、華中、華北、西北、東北6個地區16個省市自治區屠宰場和非健康豬場采集的1310份組織樣品和828份血清樣品進行檢測，結果顯示，華東、華南、華中、華北、西北、東北地區組織樣品陽性率分別為4.07%、17.06%、29.27%、0、2.65%、0，華東、西北地區血清樣品陽性率分別為6.98%、15.17%，其中華北地區均為陰性，而華北地區采樣集中在天津地區、河北省，未出現感染情況，與本研究所得出的結論一致，但華中、華南、華東等地區均有不同程度的感染。穆國冬等[2]人利用間接ELISA和熒光定量RT-PCR方法對吉林省7個縣規模豬場和生豬屠宰場采集的420份樣品進行檢測，結果顯示，抗體陽性率6.2%，病原陽性率4.8%，說明該病在吉林省已經出現區域性流行，具有一定的感染趨勢。熊杰等[3]人利用實時熒光RT-PCR方法對攀枝花地區送檢的100份血清進行檢測，結果顯示，所有樣品均為SVA抗原陰性，說明攀枝花地區尚未出現SVA感染。

4 結論

本研究檢測表明，天津地區豬塞內卡病毒病尚未出現感染，但該病目前沒有商品化疫苗，絕不可掉以輕心，因此豬場要加強疫病的防控，做好科學的飼養管理和嚴格的生物安全措施。同時，有關部門和機構要高度重視該病的防控，加強檢疫監管，開展回溯性研究和主動監測工作。