載阿替普酶磁性明膠納米粒的構建及其溶栓作用研究

張文麗，郭大靜，王俊銳，鐘毅欣，冉海濤，張瑜*

1重慶醫科大學附屬第二醫院放射科，重慶 400010；2超聲分子影像重慶市重點實驗室，重慶 400010

血栓形成是各類血栓性疾病如急性肺動脈栓塞、急性心肌梗死和深靜脈血栓形成等的主要發病機制。當前臨床治療血栓性疾病的首選方式是靜脈注射纖溶藥物，利用藥物激活纖溶酶活性，分解由致密纖維蛋白網狀結構與血小板交織而成的血栓，最終促進血凝塊溶解，恢復血管通暢[1-2]。但是溶栓藥物的廣泛應用并未顯著改變血栓性疾病的高致殘率和高致死率[3]。為了解決臨床血栓性疾病治療的不足，我們引入納米藥物遞送系統，試圖利用其靶向輸送的特點，實現纖溶藥物的精準輸送；其次，磁性納米可以在近紅外光(near infrared，NIR)介導下通過朗道阻尼效應將光能快速轉化為熱能，為血栓性疾病提供新的治療策略[4-5]，加之磁性納米粒在分子影像學領域中具有良好的發展前景，為血栓性疾病有限治療窗口的診療一體化帶來了更多可能[6]。基于以上理論，本研究以明膠(gelatin，Gel)為納米載體，包裹溶栓藥物阿替普酶(alteplase，rt-PA)以及具備光聲(PA)和磁共振(MR)成像能力的磁性四氧化三鐵(Fe3O4)顆粒，靶向連接血栓纖維蛋白的五肽——半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-賴氨酸-丙氨酸(Cys-Arg-Glu-Lys-Ala，CREKA)，構建靶向診療一體化雙模態顯像納米粒CREKA-Fe-rt-PA-Gel，并探究其體外雙模態顯像潛能與光熱增效溶栓效果及其體內靶向血栓的能力。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑 rt-PA(德國勃林格殷格翰公司)；Fe3O4(西安瑞禧生物科技有限公司)；CREKA多肽、異硫氰酸熒光素(FITC)-CREKA多肽、FITC-纖維蛋白原、人凝血酶(江蘇強耀生物科技有限公司)；A型Gel、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(美國 Sigma-Aldrich 公司)；丙酮、戊二醛(重慶川東化工有限公司)；細胞膜紅色熒光探針DiIC18(3)(DiI，博士德生物技術有限公司)。

1.1.2 儀器 聲震儀(美國 Sonics ＆ Materials 公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90光粒徑測量儀；BD FACS Vantage SE流式細胞儀；Lecia TSCCP2激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)；ELX800 酶標儀(美國 Bio-Rad公司)；Shmadzu LC-2-1A HT 高效液相色譜儀(日本島津公司)；FC-80-2W-MM 808 nm激光器(中國Mid-River公司)；Fotric 220 近紅外熱成像儀(中國Fotric公司)；Vevo LAZR 光聲成像系統(加拿大 Visual Sonics 公司)；3.0 T 磁共振成像(MRI)掃描儀(德國SIEMENS公司)。

1.2 細胞 人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，由重慶醫科大學超聲影像研究所提供。

1.3 實驗動物 8～10周齡雌性SD大鼠30只，體重170～200 g；6～8周齡雌性昆明小鼠20只，體重18～20 g。均由重慶醫科大學動物中心[實驗動物生產許可證號：SCXK(渝)2018-0003]提供。本研究經重慶醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準(批準文號：2020年科倫審第44號)，實驗過程符合國家和單位有關實驗動物管理及使用的規定。

1.4 納米粒制備 采用二次去溶劑法制備Gel納米粒[7]，將制備好的Gel納米粒稀釋至50 ml。制備CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒：取 2.5 ml Gel納米粒溶液，將200 μl Fe3O4(10 mg/ml)溶于1.3 ml PBS后加入Gel納米粒溶液中連續聲震 20 min，然后將1 mg rt-PA 溶于1 ml PBS 溶液，加入上述溶液后繼續聲震5 min。離心洗滌去除未反應的Fe3O4及rt-PA，將上述納米粒(10 mg/ml)加入 PBS 溶液(pH=6)，以2:1的比例加入EDC、NHS，常溫下孵育2 h活化納米粒表面的羧基端，離心洗滌去除未反應的 EDC、NHS，加入PBS(pH=8)及CREKA多肽繼續攪拌，待12 h后離心洗滌，制得CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒。

1.5 納米粒相關表征測定 以透射電鏡觀察CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的形態，以粒徑儀檢測其粒徑、分布及表面電位。在Gel納米粒制備過程中，將DiI加入丙酮中標記Gel，在CREKA-Fe-rt-PAGel納米粒制備過程中使用FITC標記CREKA，通過激光共聚焦顯微鏡觀察制備后納米粒的熒光顏色以驗證CREKA多肽連接是否成功。將未標記的Fert-PA-Gel作為對照組，DiI標記的CREKA-Fe-rt-PAGel作為實驗組，采用流式細胞儀分析熒光標記以驗證CREKA多肽的攜帶率。配制不同濃度 (31.25、62.50、125.00、250.00、500.00、1000.00 μg/ml)rt-PA，采用高效液相色譜儀(色譜柱Welch-C18)繪制rt-PA標準曲線，以有機溶劑二甲基亞砜破壞納米粒后再次檢測并分析rt-PA含量。rt-PA包封率=rt-PA實際含量/rt-PA投入量×100%。加入不同含量(0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg)Fe3O4制備CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米溶液，離心取上清，采用有機溶劑二甲亞砜破壞上清液成分后以電感耦合等離子質譜檢測上清液Fe3O4含量。Fe3O4包封率(%)=(Fe3O4投入量－上清液Fe3O4含量)/Fe3O4投入量×100%。將CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒凍干，采用振動樣品磁強計分析其磁學性能。

1.6 體外光熱效應測定 將CREKA-Fe-rt-PA-Gel按不同濃度(1.0、2.0、4.0、8.0 mg/ml)分為4組，并設置0.9%氯化鈉注射液作為空白對照組；每組取200 μl分別置于96孔板中，采用808 nm激光(2.0 W/cm2)輻照20 min。相同濃度 CREKA-Fe-rt-PAGel(4 mg/ml)分別經808 nm激光(1.0、1.5、2.0 W/cm)輻照20 min。以熱成像儀檢測各組溫度變化。為探究該納米粒的穩定性，以固定濃度(4.0 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel為研究對象，經808 nm激光(2.0 W/cm2)輻照5 min，停止激光輻照，溫度降至室溫后繼續前面的輻照流程并循環5個周期。各組納米粒輻照過程均采用成像儀監控記錄溫度變化情況。

1.7 體外雙模態顯像

1.7.1 體外PA顯像 制備瓊脂糖凝膠模型，將不同濃度(0.125、0.250、0.500、0.750、1.000、1.250、1.500 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel溶液各200 μl 加入凝膠模型中，使用光聲成像儀以一定波長(680～970 nm)輻照各組納米粒溶液，采集相應的光聲圖像，并利用儀器自帶后處理軟件測量最強信號處的波長。

1.7.2 體外MR顯像 將不同濃度(0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel溶液各1.5 ml加入微型離心管中，使用3.0 T MRI采集T2加權像(T2WI)，利用后處理軟件測得圖像的R2(1/T2)值。同時采集偽彩圖，并獲取相應的信號強度。

1.8 體外安全性試驗

1.8.1 細胞毒性試驗 以含1%雙抗、10%胎牛血清的RPMI 1640培養基于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育HUVEC細胞。將HUVEC細胞置于96孔板中，待細胞貼壁且生長融合面積達到50%左右時，棄去舊培養基，分別加入不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel孵育24 h，棄去舊培養基，用PBS清洗3次，每孔加入100 μl含10%CCK-8的新鮮培養基孵育1 h，使用酶標儀檢測吸光度A450，每組測量5次。

1.8.2 溶血試驗 在輕度麻醉下從昆明小鼠眼眶收集血液樣本。通過離心(3000 r/min，15 min，4 ℃)獲得紅細胞，并用PBS(pH=7.4)清洗3次，直到上清液變成無色；將獲得的紅細胞沉淀稀釋10倍；分別將0.5 ml rt-PA、Gel-rt-PA、Gel-rt-PA-Fe、CREKA-Fert-PA-Gel 與0.5 ml紅細胞混合作為實驗組，0.5 ml去離子水與0.5 ml紅細胞混合作為陽性對照組，0.5 ml PBS與0.5 ml紅細胞混合作為陰性對照組。所有樣品在37 ℃孵育4 h，3000 r/min離心15 min獲取上清液。使用酶標儀在540 nm處測定上清液的吸光度。溶血率(%)=(A實驗組－A陰性對照組)/(A陽性對照組－A陰性對照組)×100%。

1.9 體外溶栓效果評估

1.9.1 體外溶栓試驗 在輕度麻醉下用1.5 ml微型離心管從昆明小鼠眼眶收集多個0.5 ml血液樣本，4 ℃放置24 h形成凝塊，PBS清洗3次，分別設置NIR組、rt-PA(0.04 mg/ml)組、Gel-rt-PA+NIR組、Gelrt-PA-Fe+NIR組、CREKA-Fe-rt-PA-Gel+NIR組，將血凝塊與上述各組溶液(4 mg/ml)孵育3 h，激光輻照(2 W/cm2，20 min)處理后取溶液3000 r/min離心15 min，使用酶標儀分別在540 nm及450 nm處測定上清液吸光度，作為血紅蛋白和纖維蛋白的含量指標來評估溶栓效果。

1.9.2 FITC標記的纖維蛋白凝塊試驗 將25 U/ml凝血酶和2.5 mmol氯化鈣加入含有5 mg/ml FITC標記的纖維蛋白原(200 μl)溶液中，37 ℃孵育1 h，誘導FITC標記的纖維蛋白凝塊；將纖維蛋白凝塊與CREKA-Fe-rt-PA-Gel孵育1 h，并進一步用808 nm激光(2 W/cm2，5 min)照射，設置對照組、CREKAFe-rt-PA-Gel組、NIR組、CREKA-Fe-rt-PA-Gel+NIR組，采用CLSM評估各組纖維蛋白網狀結構的損傷程度。

1.10 體內靶向性能觀察 分離SD大鼠左側頸總動脈，以寬度為0.5 cm的濾紙蘸取10% FeCl3分別包裹左側頸總動脈15 min及10 min，構建完全栓塞和部分栓塞的血栓模型，使用0.9%氯化鈉注射液沖洗殘余FeCl3。為觀察納米粒在體內血栓上的分布，建立血栓模型1 h后，分別將1 ml濃度為 5 mg/ml DiI標記的納米粒(CREKA-Fe-rt-PA-Gel、Fe-rt-PA-Gel)經尾靜脈注入大鼠體內，1 h后在深度麻醉下處死，取頸動脈，制備厚度為 10 μm的切片并進行HE染色。在光學顯微鏡及熒光顯微鏡下觀察兩組(Fe-rt-PAGel組和CREKA-Fe-rt-PA-Gel組)納米粒在血栓中的分布情況。

1.11 統計學處理 采用 GraphPad 8.0.2軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CREKA-Fe-rt-PA-Gel的基本特征 構建的CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒(圖1A)在透射電鏡下呈大小均一的圓形(圖1B)，粒徑(254.79±6.83) nm，電位(5.48±4.60) mV(圖1C)，多分散系數(0.09±0.05)。激光共聚焦觀察顯示FITC標記的CREKA多肽成功連接在DiI標記的Fe-rt-PA-Gel上(圖1D)，流式分析顯示連靶率為98.66%(圖1E)。高效液相色譜法計算的藥物標準曲線為y=37887x+327636，對應標準曲線計算得到rt-PA的包封率為23.03%±0.05%(圖1F)；電感耦合等離子質譜檢測顯示，隨著投入Fe3O4含量的增加，納米粒中Fe3O4實際含量也隨之增加，計算得出Fe3O4包封率為92.78%±0.57%(圖1G)；磁滯回線顯示CREKA-Fe-rt-PA-Gel沒有明顯的剩余磁化強度，為順磁性(圖1H)。

圖1 CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的基本特征Fig.1 Basic characterization of the nanoparticles (CREKA-Fe-rt-PA-Gel)

2.2 體外光熱效應 激光輻照不同濃度CREKA-Fert-PA-Gel，10 min時溫度上升趨于平穩，隨著納米粒溶液濃度升高和輻照時間延長，溫度上升更加明顯，光熱效能表現出顯著的濃度依賴性和時間依賴性，而對照組溫度未見明顯上升(圖2A)。不同強度的激光輻照CREKA-Fe-rt-PA-Gel，激光強度越高，輻照時間越長，溫度上升越明顯(圖2B)。在5個循環光熱輻照下，CREKA-Fe-rt-PA-Gel表現出較好的光熱穩定性(圖2C)。為了避免溫度過高對組織的損傷，選擇CREKA-Fe-rt-PA-Gel濃度4 mg/ml、激光強度2 W/cm2、輻照時間20 min進行后續實驗。

2.3 體外雙模態顯像 PA顯像顯示CREKA-Fe-rt-PA-Gel在690 nm處的PA信號最強，與Fe3O4的PA吸收峰一致；在此波長下PA信號隨濃度增加逐漸增強，呈線性改變(圖2D)。MR顯像顯示CREKA-Fert-PA-Gel具有T2加權成像能力，且隨著CREKA-Fert-PA-Gel濃度增加T2信號逐漸減弱，呈線性相關(圖2E)。MR偽彩圖顯示其信號強度均勻(圖2F)。

圖2 CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的體外光熱效應及雙模態成像Fig.2 Photothermal effect and dual-mode imaging of the nanoparticles (CREKA-Fe-rt-PA-Gel) in vitro

2.4 細胞毒性及溶血反應 CCK-8法檢測顯示，HUVEC與不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/ml)CREKA-Fe-rt-PA-Gel孵育24 h后，細胞的存活率均＞90% (圖3A)，各組之間差異無統計學意義(F=2.748，P＞0.05)。溶血反應結果顯示，與陰性對照組比較，各實驗組溶血率均遠低于上限(5%)；同時，陽性對照組出現明顯的溶血現象(圖3B)。

2.5 體外溶栓試驗 將血凝塊分別與Gel-Fe、Gel-rt-PA-Fe、CREKA-Fe-rt-PA-Gel共培養并用NIR激光輻照。與NIR組相比，r t-PA組溶液中的纖維蛋白和血紅蛋白含量差異無統計學意義(P＞0.05)；與NIR組(0.084±0.005)及rt-PA組(0.112±0.005)相比，Gel-rt-PA組(1.176±0.062)、Gel-rt-PA-Fe組(1.510±0.046)、CREKA-Fe-rt-PA-Gel組(2.226±0.047)纖維蛋白含量明顯增加，差異均有統計學意義(P＜0.01)。此外，與NIR組(0.075±0.005)及rt-PA組(0.100±0.009)相比，Gel-rt-PA組(0.702±0.123)、Gel-rt-PAFe組(0.949±0.027)、CREKA-Fe-rt-PA-Gel組(1.459±0.021)血紅蛋白含量明顯增加，差異均有統計學意義(P＜0.01)。CREKA-Fe-rt-PA-Gel組纖維蛋白和血紅蛋白含量均為最高(圖3C)。

2.6 FITC標記的纖維蛋白凝塊試驗 將纖維蛋白與CREKA-Fe-rt-PA-Gel共培養并用NIR激光輻照5 min后，與未經任何處理的綠色熒光(FITC)標記的纖維蛋白相比，CREKA-Fe-rt-PA-Gel組及NIR組纖維蛋白結構未見明顯改變，而CREKA-Fe-rt-PAGel+NIR組纖維蛋白結構出現大量塌陷的骨架和小片(圖3D)。

圖3 CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的體外生物安全性及溶栓試驗結果(n=3)Fig.3 Biosafety and thrombolysis test of the nanoparticles (CREKA-Fe-rt-PA-Gel) in vitro (n=3)

2.7 體內靶向性能 成功構建大鼠左側頸總動脈血栓模型(圖4A)。在光學顯微鏡下可見正常血管管腔無填充，其血管壁可見深染的細胞核；完全栓塞血管管腔可見均勻一致的顏色，其血管壁可見深染的細胞核(圖4B)。為了避免血管壁中細胞核HE染色對實驗的干擾，選擇部分栓塞的血管進行靶向性研究，在光學顯微鏡下，Fe-rt-PA-Gel組血栓中僅可以見部分納米粒，而CREKA-Fe-rt-PA-Gel組血栓中可見更多的納米粒分布(圖4B)。

圖4 大鼠頸總動脈血栓模型及CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒的體內靶向性試驗 (n=3)Fig.4 Thrombus model in common carotid artery of rats and test of targeting ability of the nanoparticles (CREKA-Fe-rt-PA-Gel)in vivo (n=3)

3 討 論

為了解決臨床血栓性疾病治療的不足，本研究引入了納米藥物遞送系統，旨在利用其靶向運輸的特點實現纖溶藥物的精準輸送，并聯合光熱療法(PTT)，以增強藥物溶栓的效果。當前臨床常規藥物溶栓治療存在以下不足：(1)纖溶藥物的作用缺乏纖維蛋白特異性，在溶解病理性血栓纖維蛋白的同時也會溶解生理性纖維蛋白，甚至導致高出血風險(例如，鏈激酶SK在活動性出血3個月內禁用)；(2)藥物循環壽命較短[例如，組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的半衰期僅為2～6 min]，在血液循環中的快速清除和酶降解高度限制了治療窗口[8-10]；(3)單一的藥物溶栓聯合外科輔助治療造成了高成本、高風險，需要復雜的臨床風險監控。

PTT由于其對腫瘤組織的熱消融作用已經成功地用于部分腫瘤的治療，作為腫瘤替代療法具有較好的臨床應用前景[11-12]。基于目前臨床血栓性疾病治療的局限性，有研究者提出了光熱溶栓的輔助治療方法[13]。利用光吸收劑在NIR輻射下使局部溫度升高，從而破壞血凝塊的纖維蛋白網絡，達到溶栓效果[14]。借助納米藥物遞送系統的精確性和可忽略的侵入性，本研究構想的光熱增效溶栓策略有望進一步改善臨床血栓性疾病的治療效果。

由于Fe3O4在NIR區具有較強的吸收峰，不僅可以利用分子影像學的優勢作為磁性造影劑進行PA[15]，而且可以利用朗道阻尼效應將光能快速轉化為熱能進行PTT治療。同時，Fe3O4固有的順磁性不僅能實現MR顯像，還有望被外置磁體吸附而進一步用于磁導航溶栓治療。本研究利用Fe3O4的這些性能構建的磁性CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒，其粒徑為(254.79±6.83) nm，多分散系數為(0.09±0.05)，大小均一、分散性良好，此外，其連靶率及Fe3O4包封率高，光熱效能表現出明顯的輻照強度依賴性和時間依賴性，在5個循環光熱輻照下具有明顯的光熱穩定性，激光強度越高，輻照時間越長，溫度上升越明顯。良好的光熱能力為其用于血栓治療奠定了基礎。PA顯像顯示，CREKAFe-rt-PA-Gel在690 nm處的PA信號最強，與Fe3O4的PA吸收峰一致，提示CREKA-Fe-rt-PA-Gel沒有改變Fe3O4本身的性質；MR顯像顯示其具有T2加權成像能力，MR偽彩圖顯示其信號強度均勻。體外成像試驗顯示，CREKA-Fe-rt-PA-Gel具有良好的PA/MR雙模態成像潛能，有望作為分子影像的造影劑。

本研究細胞毒性試驗中，HUVEC細胞與不同濃度的CREKA-Fe-rt-PA-Gel孵育24 h后，細胞存活率均＞90%，提示CREKA-Fe-rt-PA-Gel對細胞無明顯毒性。溶血反應結果顯示，與PBS組(陰性組)比較，各組納米粒的溶血率均遠低于上限(5%)，而陽性對照組出現明顯的溶血現象，提示CREKA-Fe-rt-PAGel具有良好的生物安全性和血液相容性，可用于體內研究。

本研究體外溶栓試驗中，血凝塊與Gel-rt-PA、Gel-rt-PA-Fe、CREKA-Fe-rt-PA-Gel共培養并用NIR激光輻照后，Gel-rt-PA、Gel-rt-PA-Fe、CREKA-Fert-PA-Gel組纖維蛋白和血紅蛋白含量明顯高于NIR組及rt-PA組，且CREKA-Fe-rt-PA-Gel組含量最高，提示該磁性載藥納米遞送系統聯合光熱增效具有較強的溶栓能力。更為重要的是，將纖維蛋白與CREKA-Fe-rt-PA-Gel共培養并用NIR激光輻照5 min后，與未經任何處理的綠色熒光(FITC)標記的纖維蛋白相比，單純CREKA-Fe-rt-PA-Gel組和NIR組纖維蛋白結構未見明顯改變，而CREKA-Fe-rt-PAGel+NIR組纖維蛋白出現大量塌陷的骨架和小片，直觀地顯示了光熱增效溶栓的機制為破壞血栓中致密的纖維蛋白網狀結構，提示CREKA-Fe-rt-PA-Gel聯合光熱作用能夠破壞纖維蛋白骨架。相比傳統的單純藥物溶栓，納米粒聯合PTT實現了更強的溶栓效果，這為臨床血栓性疾病的治療提供了新的選擇。光熱增效溶栓的機制在于單純的CREKA-Fe-rt-PA-Gel納米粒或NIR并不能損傷血栓纖維蛋白，但納米粒聯合NIR產生光熱效應時卻能毀損血栓中致密的纖維蛋白網狀結構。究其原因，可能是光熱使纖維蛋白發生熱損傷而使其網狀結構破壞。另外，納米粒在修飾了CREKA多肽后，可增強其體內應用的靶向性，有助于增強后續體內治療的效果，而且有可能減輕藥物溶栓造成出血并發癥的弊端。但本研究未對血栓體內多模態成像與體內溶栓治療效能進行深入探討；Fe3O4作為光吸收劑具有較好的應用前景，但在光熱治療過程中，可能損傷相鄰組織結構，其達到最大安全治療效果的臨界溫度尚待進一步探究，這也是今后的研究方向。

總之，本研究構建了靶向診療一體化的載rt-PA磁性明膠納米粒——CREKA-Fe-rt-PA-Gel，其血液相容性較好，可用于PA/MR雙模態顯像，具有良好的光熱性能；CREKA-Fe-rt-PA-Gel聯合光熱治療具備較強的溶栓效果。目前關于光熱溶栓的研究尚處于初級階段，值得進一步深入探討。