Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤干細胞中的作用研究進展

田宇佳，魏銘，趙輝

1大連醫科大學附屬第二醫院研究生院，遼寧大連 116027；2大連市第三人民醫院呼吸與危重癥醫學科，遼寧大連116091；3大連醫科大學附屬第二醫院健康管理中心，遼寧大連 116027

《2020年全球癌癥報告》指出，2020年全球新發惡性腫瘤約1929萬例，其中乳腺癌、肺癌居前兩位，且呈逐年增長趨勢；全球惡性腫瘤死亡近996萬例，成為全球第二大死亡原因，其中肺癌、乳腺癌、大腸癌等惡性腫瘤的死亡率呈升高趨勢[1]。目前，惡性腫瘤的檢查和診斷手段已取得很大進步，提高了腫瘤的診斷率，新的治療手段的出現也為腫瘤治療提供了更多的方案。然而，惡性腫瘤生長迅速，確診時往往已出現遠處轉移，且針對已經發生靶器官轉移的晚期腫瘤患者治療手段有限，療效不理想[2]。因此，研究腫瘤發生發展的機制對于腫瘤的診斷、治療具有重要的臨床意義。對腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)深入研究發現，CSCs與腫瘤的形成、侵襲和復發密切相關[3]，而Wnt/β-catenin信號通路在CSCs中發揮著關鍵作用[4]。因此，了解和掌握Wnt/β-catenin信號通路在不同CSCs中的作用，有可能為惡性腫瘤的治療和預防提供新的靶點和研究方向。

1 CSCs概述

在腫瘤組織中，少數腫瘤細胞由于多基因突變而停止在某個分化階段無限增殖，具有干細胞的特性，被稱為CSCs。腫瘤干細胞學說認為CSCs具有以下幾個主要特點：一是自我更新、無限增殖和多向分化的能力，可啟動腫瘤發生，是腫瘤生長的根源[5]；二是較強的促血管生成能力和致瘤性，可維持腫瘤營養供給并促進其生長[6-7]；三是對放療和化療藥物有較強的抵抗力，這可能是腫瘤耐藥、侵襲、復發的根本原因[8]。目前，在造血系統腫瘤[9]、乳腺癌[10]、腸癌[11]、腦膠質瘤[12]等惡性腫瘤組織中均證實了CSCs的存在。CSCs不僅與腫瘤的形成和進展有關，也與腫瘤的復發和耐藥密切相關。在腫瘤治療過程中，應用傳統方法完全殺滅CSCs十分困難，尤其是已經轉移到血液或靶器官的CSCs，而這部分CSCs也是引起腫瘤復發的關鍵因素[13]。因此，只有殺滅CSCs才是真正意義上的根治腫瘤。

CSCs的表面一般存在有助于區分其與其他腫瘤細胞的標志物，如ALDH1、CD133、CD44和SOX2等，這些標志物在不同組織和腫瘤中的表達水平并不完全相同[14]。此外，CSCs可通過多種信號通路如Wnt/β-catenin、Notch、JAK/STAT、Hippo-YAP/TAZ等發揮干細胞樣特性，其中Wnt/β-catenin信號通路發揮著重要作用[4]。

在Wnt信號通路中，Wnt配體與膜蛋白受體結合后可引起一系列信號因子的改變。Wnt/β-catenin信號通路作為經典的Wnt信號通路發揮著重要作用，當沒有Wnt配體激活該通路時，β-catenin聚集在細胞質內，無法向核內易位，迅速被糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)磷酸化并隔離在破壞復合體(由APC-Axin-GSK3β-CK1組成)中，導致相關的蛋白酶體降解；當有Wnt配體存在時，Wnt配體結合細胞膜上的卷曲同源物和肺耐藥蛋白5/6(lung resistance related protein 5/6，LRP5/6)受體共表達，引起散亂蛋白聚集，使該通路呈激活狀態，細胞質內的β-catenin不能被GSK3β磷酸化，故大量積累并向細胞核內易位，與T細胞特異性因子(TCF)/淋巴樣增強因子(LEF)或共活化因子(如Pygo和Bcl-9)互動，調節Wnt信號通路下游靶基因(如c-myc、Axin2和DKK1等)的表達，最終發揮相應的功能[15]。最新研究發現，Wnt/β-catenin信號通路在調控CSCs的自我更新、增殖及腫瘤形成、侵襲、轉移和耐藥方面起著至關重要的作用[16]。

2 Wnt/β-catenin信號通路在CSCs中的作用

2.1 在腸癌干細胞(colorectal cancer stem cells，CCSC)中的作用 腸道腫瘤發生發展的主要原因是Wnt/β-catenin信號通路的過度激活[17]。APC-Axin-GSK3β-β-catenin復合體中任一基因突變或缺失都可激活此通路，導致CCSC過度更新、增殖和轉移，有利于腫瘤形成[11]。富亮氨酸重復序列G蛋白偶聯受體5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5，LGR5)是一種新鑒定的CCSC表面標志物，也是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵分子。LGR5在腸癌細胞中表達增加，當其缺失時，β-catenin的核內易位減少，同時c-myc和Cyclin D轉錄水平下降，誘導CCSC凋亡并使其生長受到抑制[18]。此外，多種重要因子也可通過Wnt/β-catenin信號通路調控CCSC的干性特征，如RNA結合蛋白3(RNA binding motif containing protein 3，RBM3)在HCT 116和DLD-1腸癌細胞系中過表達，導致側群細胞占比增加，細胞球體數量增多，干細胞標志物(DCLK1、LGR5和CD44)表達增加，提示RBM3可促進CCSC的自我更新。RBM3過表達可增高核內β-catenin水平和TCF/LEF的轉錄活性，還可使GSK3β失活，導致β-catenin磷酸化水平降低，從而維持CCSC的增殖能力[19]。Zeste同系物2(Zeste homologue 2，EZH2)可通過激活Wnt/β-catenin信號通路使細胞周期停滯在G1/S期，從而維持CCSC的增殖能力[20]。環境改變也可通過Wnt/β-catenin信號通路影響CCSC的干性特征，如缺氧使CCSC表型(c-myc、SOX2和Oct4)和編碼DNA結合蛋白的抑制因子2(inhibitor of DNA-binding 2，Id2)表達增加，在信號轉導后β-catenin的穩定性增加，Wnt/β-catenin信號分子(Wnt1、TCF4和Cyclin D)表達增加，提示缺氧可通過激活Wnt/β-catenin信號通路增強體內和體外CCSC的增殖克隆能力。相反，Wnt/β-catenin信號通路抑制劑可抑制缺氧誘導的CD44+CCSC球體的形成，降低Id2的表達水平[21]，而Id2水平升高可減緩小鼠移植瘤的生長速度。由此可見，Wnt/β-catenin信號通路和Id2共同介導了缺氧所致的CCSC增殖和轉移[21]。

MicroRNAs(miRNAs)可能是CCSC特性的調節器，不僅調控其自我更新和增殖能力，還可維持其侵襲和轉移能力[22-23]。在腸癌中已經發現多種miRNAs通過Wnt/β-catenin信號通路調控CCSC的功能。miR-21、miR-93、miR-203、miR-215、miR-497可調控CCSC的生長和生存信號，從而調節惡性腫瘤的治療敏感性[24]。在HCT 116和SW480細胞系中加入miR-3120-5p，細胞中Oct4、SOX2和Nanog的表達增加，腫瘤細胞的球體形成能力增強，表明miR-3120-5p促進了細胞的自我更新和克隆形成。同時，負調控因子Axin2的表達水平下降，核內β-catenin增多，表明miR-3120-5p可通過Wnt/β-catenin信號通路促進細胞的自我更新和增殖[25]。選擇性抑制Axin2的靶點，可導致Wnt信號通路下游信號轉錄反應及時終止。高表達miR-103/107可通過靶向抑制Axin2、上調β-catenin而延長Wnt/β-catenin信號的持續時間。Wnt/β-catenin信號通路激活可增加CCSC標志物(CD44+)的表達和側群細胞的數量，也可增加腫瘤球體的數量和體積，使其致瘤能力增強100倍[26]。miR-103/107-Axin2軸參與了化療耐藥和腫瘤復發。在裸鼠皮下植入攜帶熒光素酶的HCT 116衍生物，待原發腫瘤長至50 mm3時手術切除腫瘤，8周后應用活體成像系統監測原發部位或遠處腫瘤的復發情況，結果顯示對照組小鼠腫瘤未復發，但注射miR-103/107過表達細胞的小鼠出現腫瘤復發，提示miR-103/107-Axin2軸可能為治療侵襲性大腸癌的潛在靶點[26]。此外，miR-199a/b通過下調CCSC內GSK3β的表達和上調β-catenin而激活Wnt/β-catenin-ABCG2途徑，促進CCSC的耐藥與侵襲[27]。菱形結構域蛋白1(rhomboid domain containing 1，RHBDD1)在腸癌中高表達，可促進淋巴結轉移及遠處轉移，其機制為過表達的RHBDD1通過降低β-catenin在細胞質內的磷酸化水平，上調Wnt信號通路靶基因ZEB1的表達，從而促進結直腸癌轉移[28]。RHBDD1可維持干細胞樣表型并促進結直腸癌發生上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[28]。KDM3家族組蛋白去甲基化酶(KDM3 family histone demethylases)是一種表觀遺傳因子，對CCSC的致瘤潛能、存活能力和轉移潛能具有重要作用。KDM3可募集組蛋白甲基轉移酶MLL1促進H3K4甲基化，從而上調Wnt靶基因(Axin2、DKK1和c-myc)的表達[29]。因此，上下游靶點失控導致了Wnt/β-catenin信號通路的激活，引起CCSC在遠處定植后發生無限增殖、自我更新，最終形成腫瘤。靶向阻斷該通路的信號轉導抑制CCSC的干性特征，可抑制腸癌的發生、發展、轉移和治療耐藥性。

2.2 在肺癌干細胞(lung cancer stem cells，LCSC)中的作用 Wnt/β-catenin信號通路參與調控LCSC的增殖、克隆形成、轉移和耐藥[30]，這與β-catenin的核內積聚密切相關。β-catenin可通過上調LCSC標志物Oct4的表達，增強細胞的增殖、克隆、遷移和耐藥能力。應用伊曲康唑誘導A549細胞株后，β-catenin和CD133表達下調，肺癌細胞的干細胞特性相應下降[31]。Wnt/β-catenin信號通路下游分子CD44在肺癌中過度表達，過表達的CD44可促進β-catenin向核內易位，激活Wnt/β-catenin-FOXM1-Twist信號轉導通路，引起CD133+、CD44+肺腺癌干細胞發生侵襲和轉移[32]。Roy等[33]發現，使用1,2,3,4-四氫異喹啉(THIQ)抑制CD44可調控Wnt/β-catenin信號蛋白的表達，而沉默β-catenin可降低CD44的表達，表明CD44與β-catenin之間存在蛋白-蛋白相互作用。抑制CD44可使順鉑耐藥的CSCs對順鉑趨化，從而改善腫瘤患者的預后。Wnt/β-catenin通路激活后，下游因子FOXM1誘導CD133+、CD44+LCSC發生EMT，導致癌細胞侵襲和擴散能力明顯增強[32]。CD44作為LCSC的標志物，可激活Wnt/β-catenin信號通路，上調Nanog和Oct3/4的表達，增強肺癌細胞的自我更新能力和耐輻射性[32]。Liu等[34]發現，沉默β-catenin可抑制Oct4、Nanog介導的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)耐藥性和EMT過程。Wnt/β-catenin信號通路是治療具有CSCs樣特性和EMT表型的NSCLC進展和轉移的潛在靶點。Wnt/β-catenin信號通路過度激活可啟動腫瘤血管生成，這與肺癌的發生和發展關系密切。MORC家族CW型鋅指蛋白2(MORC2)是一種高度保守的蛋白，與多種惡性腫瘤的形成、生長有關。研究發現，MORC2在肺癌A549細胞株中過度表達，致使β-catenin核內易位增多，同時血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-7、MMP-9、MMP-2表達水平升高，促進腫瘤血管生成，導致腫瘤擴散和生長[35]。MORC也可增加LCSC標志物ALDH1的表達，維持LCSC的干性特征。絲氨酸-精氨酸蛋白激酶1(serine-arginine protein kinase 1，SRPK1)在NSCLC中過度表達，使肺癌A549和Calu3細胞系中β-catenin核內易位和TCF/LEF轉錄活性增強，導致靶基因CD44、CCND1、c-myc和c-jun表達增加，促進血管生成，從而導致腫瘤的發生[36]。相反，抑制SRPK1可降低β-catenin核內易位和靶基因的轉錄活性，從而抑制LCSC的增殖、克隆形成、成瘤潛能、轉移和耐藥性[37]。因此，上述因子可通過正向調控Wnt/β-catenin信號通路而維持LCSC的功能和特性，對肺癌的治療和預后判斷具有重要參考價值。

此外，一些負向調控因子如Axin2、DKK3、GSK3β和上皮鈣黏素(E-cadherin)等通過Wnt/β-catenin信號通路維持LCSC的功能和特性。研究發現，miR-582-3p可下調Axin2、DKK3和SFRP1的表達，促進肺癌的復發、轉移和耐藥[38]。相反，拮抗miR-582-3p可有效抑制異種移植瘤小鼠肺癌的發生和發展[38]。miR-19a/b可靶向抑制GSK3β的表達，激活Wnt信號通路，促進LCSC的自我更新、增殖、克隆和耐藥[39]。此外，E-cadherin可抑制β-catenin從細胞膜向細胞質內轉運，從而影響干細胞的功能[40]。下調肺癌A549細胞株中E-cadherin的表達，可上調巢蛋白(Nestin)、c-myc、Oct3/4和β-catenin的表達，促進CSCs的增殖、血管形成、生長和侵襲[41]。上調E-cadherin的編碼基因CDH1后，可抑制Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的轉錄活性，從而抑制LCSC的增殖、轉移和復發[42]。上述因子表達下調可促進Wnt/β-catenin信號通路的激活，選擇性阻止其下調，可調控LCSC的干性特征，這為肺癌的治療提供了潛在靶點。

2.3 在乳腺癌干細胞(breast cancer stem cells，BCSC)中的作用 Wnt/β-catenin信號通路激活與BCSC的功能密切相關，在BCSC的增殖、克隆和侵襲中發揮著重要作用，其機制與乳腺癌中Nestin、LGR4、LGR5和低密度脂蛋白受體相關蛋白8(lowdensity lipoprotein receptor-related protein 8，LRP8)的高表達有關。Nestin是一種中間絲蛋白，與惡性腫瘤的發展和轉移有關。在三陰性乳腺癌中高表達的Nestin通過上調β-catenin及下調E-cadherin、Axin、GSK3β、APC和過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)，引發Wnt/β-catenin信號轉導和下游靶基因c-myc、MMP-7、MMP-2和Cyclin D的轉錄，從而促進BCSC的存活、增殖和轉移[43]。LRP8定位于乳腺癌細胞表面，具有維持BCSC特性的作用。LRP8通過增強細胞內β-catenin的活性并促使其向核內易位，使經典Wnt途徑激活，增強BCSC增殖能力、異種移植模型的致瘤潛能及耐藥性[10]。LGR4、LGR5是BCSC的重要標志物，可通過Wnt/β-catenin信號通路維持CSCs的干性特征，其機制為乳腺癌細胞中LGR4和LGR5過度表達，促進β-catenin向核內易位，下調E-cadherin的表達。Wnt/β-catenin信號通路激活導致下游靶基因c-myc、Cyclin D和Snail的表達增加，可促進BCSC的自我更新、成瘤潛力、遷移和EMT[44-45]。應用LGR5抑制劑MDAMB231處理BCSC后，Wnt3a可重新激活被抑制的Wnt/β-catenin信號通路，恢復BCSC的干性特征[45]。因此，對Wnt/β-catenin信號通路某些上游因子進行調控，可能是乳腺癌治療的新方向。

EMT過程與E-cadherin、Snail、MP-1和波形蛋白的表達密切相關，作為腫瘤侵襲和轉移過程中的一個重要環節，亦受Wnt/β-catenin信號通路的調控。Wnt/β-catenin信號通路的激活使乳腺癌細胞中E-cadherin表達水平下降，Snail、波形蛋白表達水平升高，從而促進EMT的發生，同時上調CSCs標志物(ALDH1、Nanog和Oct4)的表達，最終促進BCSC的增殖、克隆形成、轉移、EMT和耐藥[46]。相反，通過上調DKK1阻斷Wnt/β-catenin信號通路的轉導，可使MP-1、Snail和波形蛋白表達下調，抑制BCSC的生長、遷移和侵襲[47]。此外，XB130可通過PI3K/Akt信號途徑促進β-catenin向核內易位，維持乳腺癌細胞的EMT進程和干細胞樣特性[48]。PI3K/Akt軸可激活Wnt/β-catenin信號通路，促進BCSC的增殖、轉移和EMT[49]。因此，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性，靶向調節EMT相關蛋白的表達，可達到治療乳腺癌并防止復發的效果。

2.4 在膠質母細胞瘤干細胞(glioblastoma stem cells，GSC)中的作用 Wnt/β-catenin信號通路可介導神經發育過程，也可維持GSC的生存和凋亡。有研究發現，Wnt/β-catenin信號通路激活可使β-catenin在GSC中的表達增加14倍以上，提示Wnt/β-catenin信號通路可調控GSC的活性[12]。Wnt/β-catenin信號通路激活可促進膠質母細胞瘤(glioblastoma，GMB)內ZEB1的表達和EMT的發生，促進GSC的遷移和侵襲[50]。受體樣絡氨酸激酶(receptor-like tyrosine kinase，PYK)在GSC中表達明顯上調，使β-catenin核內易位增加，從而可改善細胞的運動性，穩定細胞的生長及促進神經球的形成，維持GMB的干細胞樣特性和致瘤性[51]。Wnt1、Wnt3a在GSC中過表達，下調Wnt1、Wnt3a可降低CSC的增殖、遷移、化學抗性及體內成瘤能力[52]。有研究發現，Wnt3a可抑制GSK3β的活性，穩定細胞核內KDM4c(一種JmjC結構域組蛋白去甲基化酶)與β-catenin的相互作用，調節GSC的特性，促進腫瘤的進展[53]。因此，Wnt-KDM4c-β-catenin可能成為治療GBM的新靶標。另外，GSC可自分泌Wnt誘導的信號蛋白1(Wnt-induced signaling protein 1，WISP1)，激活Wnt/β-catenin信號通路，維持腫瘤細胞的干性特征，也可通過旁分泌形式激活Wnt/β-catenin信號通路，調節腫瘤相關巨噬細胞的活性及腫瘤細胞微環境，促進腫瘤的發生與發展。肌酸可抑制Wnt/β-catenin-WISP1信號轉導，抑制腫瘤的增殖和生長[54]。由此可見，Wnt/β-catenin信號通路相關因子可作為GBM預后評估的重要指標。

此外，有研究發現，β-catenin向細胞核內轉移、GSK3β下調、APC突變或EMT等也可發生在甲狀腺癌干細胞、卵巢癌干細胞、前列腺癌干細胞、胃癌干細胞等[55-56]中，影響細胞的自我更新、增殖、轉移和耐藥。因此，Wnt/β-catenin信號通路可調控多種CSCs，在不同類型的腫瘤中發揮重要作用。

3 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑

目前針對Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑有多種類型，包括小分子抑制劑、新生血管抑制劑和重組藥物(基因、病毒)等。PRI-724是一種小分子Wnt/β-catenin信號通路抑制劑，能夠阻斷β-catenin與下游轉錄因子的相互作用[57]。既往臨床研究發現，PRI-724可誘導CSCs分化，增加CSCs對靶向藥物的敏感性[58]；其與吉西他濱聯用治療胰腺癌具有一定的效果[59]。CWP232291是一種肽類物質，能夠選擇性作用于Wnt/β-catenin轉錄產物，有效降低survivin和cyclin D1等基因的表達，活化內質網應激通路[60]。CWP232291治療難治性骨髓瘤和急性髓系白血病具有良好的效果[60]。Cho等[61]發現，Wnt抑制劑與5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)聯合應用可通過p53的介導有效抑制CSCs，抑制停藥后腫瘤的再生長，該研究強調了Wnt抑制劑與5-FU聯合治療的重要性。Wnt/β-catenin信號通路抑制劑可通過抑制該通路的活性，對某些腫瘤的預防和治療發揮重要作用。有研究發現，依他尼酸、非甾體抗炎藥、氯硝柳胺等用于治療其他疾病的藥物，也具有抑制Wnt信號通路的作用[62]。未來這些藥物可能用于治療Wnt信號通路依賴的腫瘤。

4 總結與展望

Wnt/β-catenin信號通路在CSCs中起著關鍵作用，可維持CSCs的自我更新、增殖和干細胞表型，還可促進CSCs的侵襲、轉移和耐藥。大量研究發現，阻斷乳腺癌、肺癌、腸癌、GMB、宮頸癌、前列腺癌等腫瘤Wnt/β-catenin信號通路的關鍵上下游靶點，可抑制CSCs的自我更新、增殖、腫瘤血管生成、侵襲和擴散，有效抑制腫瘤的發生與發展，同時可降低腫瘤的耐藥性，提高治療效果。Wnt/β-catenin信號通路抑制劑可有效降低該通路的活性，有望成為治療Wnt信號通路依賴腫瘤的突破點。然而，Wnt/β-catenin信號通路對CSCs的調控機制尚未完全闡明，從起源上識別并清除CSCs、早期預防腫瘤的發生仍是腫瘤防治的重點與難點。