卵巢低級別漿液性腫瘤中KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF突變及其與患者臨床病理特征和激素表達的相關性分析

陸婷，張娟娟，王晚璞，韋紅果，魏金玲，張勇，王麗*

1昆明醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，云南昆明 650500；2云南省第一人民醫院病理科，云南昆明 650500

卵巢癌是最常見的婦科癌癥之一，病死率位居首位[1]。卵巢癌的發生與遺傳、環境和生活方式等因素密切相關，懷孕、哺乳和口服避孕藥等可降低卵巢癌的發生風險[2-3]。卵巢惡性腫瘤中約90%為上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma，EOC)，其中漿液性卵巢癌(serous ovarian carcinoma，SOC)約占EOC的75%[4]。近年來，已將漿液性卵巢腫瘤分為漿液性囊腺瘤、漿液性交界性腫瘤(serous borderline tumour，SBT)、低級別漿液性癌(lowgrade serous carcinoma，LGSC)和高級別漿液性癌(high-grade serous carcinoma，HGSC)，其中SBT又分為普通型SBT和微乳頭型SBT[5-6]。目前認為，LGSC與HGSC在本質上是不同類型的腫瘤，LGSC多見于較年輕的育齡女性，通常繼發于SBT，且存在KRAS、NRAS、BRAF基因突變[7-8]。在臨床病理中，普通型SBT被認為是微乳頭型SBT的前體病變，而微乳頭型SBT則被認為是一種非浸潤性低級別漿液性癌。KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF基因是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)依賴的下游信號轉導通路RASRAF-MAPK途徑和PI3K-AKT途徑的4個重要基因，它們可持續激活下游信號通路，引起細胞異常增殖分化，導致腫瘤的發生發展[9-12]。本研究檢測KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因在卵巢低級別漿液性腫瘤中的突變情況，并分析其與臨床病理特征及雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達的關系，旨在為卵巢漿液性腫瘤的臨床診斷、治療和預后評估提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集云南省第一人民醫院病理科2017年1月－2021年4月診斷為SBT或LGSC患者的病理資料。排除標準：非原發病例；術前接受新輔助治療者；無法獲得病理石蠟切片標本及臨床信息不足者。基于世界衛生組織(WHO)和國際婦產科聯盟(FIGO)的相關診斷標準，收集所有標本對應的患者臨床資料，包括年齡、累及部位(單側或雙側)、組織學類型、腫塊大小、TNM分期、淋巴結累及情況。共納入64份甲醛溶液固定石蠟包埋(FFPE)的卵巢漿液性腫瘤組織樣本進行評估。所有組織切片均由兩位副高級別的醫師獨立復閱且診斷意見一致。本研究獲云南省第一人民醫院倫理委員會批準(KHLL2022-YJ005)，所有患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器 核酸提取試劑盒、AmoyDx人類KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF基因突變聯合檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司；免疫組化試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司；NanoDrop ND-1000購自上海賽默飛創新科技公司。光學顯微鏡購自德國Leica公司；Applied Biosystems ABI 7500購自上海邦典機電設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石蠟組織處理 為再次核對石蠟組織切片的腫瘤類型，HE染色后由兩位副高級別的病理醫師進行評估。隨后，按照試劑盒說明書提取石蠟組織DNA。具體操作步驟如下：組織脫蠟后，加入DTL緩沖液和蛋白酶K，混勻后56 ℃消化過夜；加入DES緩沖液，混勻后90 ℃孵育1 h；加入DTB緩沖液和無水乙醇，混勻后13 000×g離心1 min，離心后棄去管中液體；加入DW1緩沖液(已加入17 ml無水乙醇并充分混勻)，10 000×g離心1 min后棄去管中液體；加入緩沖液DW2(已加入24 ml無水乙醇并充分混勻)，10 000×g離心1 min后更換新的收集管，再次13 000×g離心1 min；將DNA吸附柱轉移至新的離心管，加入DTE緩沖液，靜置5 min后13 000×g離心1 min，離心管中為樣品DNA；使用NanoDrop ND-1000測定DNA濃度和純度，并將DNA稀釋至3 ng/μl待用。

1.3.2 基因突變檢測 采用擴增阻礙突變系統-聚合酶鏈反應技術檢測人類KRAS基因第2、3、4號外顯子上15種體細胞突變(其中12種為熱點突變)，NRAS基因第2和3外顯子上12種體細胞突變(其中3種為熱點突變)，PIK3CA基因20號外顯子的2種體細胞突變(其中1種為熱點突變)，BRAF基因15號外顯子的4種體細胞突變(其中1種為熱點突變)。試劑盒采用12聯PCR反應條設計，每一個12聯PCR條檢測一個樣本，12聯條的1－11號管內裝有相應的基因突變檢測和內控試劑，12號管作為DNA提取質量的外控檢測管。嚴格按照試劑盒說明書進行樣本DNA的濃度稀釋、配制、加樣、PCR反應循環參數設置及結果分析解釋。具體操作如下：分別向體積均為65.8 μl的待測樣品DNA、KNPB陽性對照(PC)和純化水(NTC)中加入4.2 μl KNPB混合酶，混勻后3000×g離心15 s；將混勻的DNA樣品依次取5 μl分別加入12聯KNPB PCR反應條中，KNPB陽性對照(PC)和陰性對照(NTC)操作同上；按照PCR反應條1－12號管方向，依次將陽性對照、陰性對照和樣本KNPB PCR反應條平行放入實時定量PCR儀檢測。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，15個循環；93 ℃ 25 s、60 ℃35 s、72 ℃ 20 s，31個循環。

1.3.3 免疫組化檢測ER、PR水平 陽性對照為乳腺導管浸潤癌組織標本切片，陰性對照則以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，嚴格按照制造商說明書進行操作。具體操作如下：將石蠟組織脫蠟至水，PBS洗3次；高壓加熱EDTA抗原修復液(pH：9.0)修復，PBS洗3次；加3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，室溫下孵育15 min后PBS洗3次；加ER抗體或PR抗體，28 ℃下孵育75 min，PBS洗3次；加酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物二抗，28 ℃下孵育45 min，PBS洗4次；DAB顯色、蘇木精復染、乙醇脫水、二甲苯透明、封片后觀察。結果判定標準：ER和PR表達均位于細胞核。以染色強度和陽性細胞綜合計分作為判定標準。染色強度(無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)和陽性細胞百分比(無陽性細胞為0分，陽性細胞≤10%為1分，陽性細胞10%～50%為2分，陽性細胞50%～75%為3分，陽性細胞>75%為4分)分值相乘，乘積不低于3分者判定為免疫組化染色陽性。

1.4 相關指標分析 分析KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變的類型和頻率，各基因的突變狀態與腫瘤組織學類型、患者臨床病理特征的關系，以及ER、PR表達與腫瘤組織學類型和各基因突變之間的關系。

1.5 統計學處理 采用SPSS 26.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，腫瘤組織中ER、PR的免疫組化評分比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以例(%)表示，各基因突變狀態與不同臨床病理特征、激素受體表達狀態之間的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 基本臨床資料 64例患者中，普通型SBT 23例，微乳頭型SBT 27例，LGSC 14例；≤35歲者30例，>35歲者34例；腫瘤累及單側42例，雙側22例；腫瘤最大徑＜10 cm者38例，≥10 cm者26例；TNM分期為早期(Ⅰ－Ⅱ期)者50例，晚期(Ⅲ－Ⅳ期)者14例；淋巴結受累者3例，淋巴結未受累者61例。

2.2KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突變的類型和頻率 共檢測出36例突變，其中KRAS突變21例、BRAF突變12例、PIK3CA突變2例、NRAS突變1例。KRAS突變均為2號外顯子的12、13密碼子突變，檢出率為32.8%(21/64)，其中G12S、G12D占42.9%(9/21)，G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*占47.6%(10/21)，G13D占9.5%(2/21)。BRAF突變檢出率為18.8%(12/64)，突變類型為V600E、V600K*、V600R*、V600D*。PIK3CA突變檢出率為3.1%(2/64)，突變類型為H1047R、H1047L*。NRAS突變檢出率為1.7%(1/64)，突變類型為G13R*、G12C*、G12V*、G12A*、G13V*。未發現KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因之間存在交叉突變。基因突變擴增圖譜詳見圖1。

圖1 卵巢漿液性腫瘤基因突變的擴增圖譜Fig.1 Amplification map of the gene mutations in ovarian serous tumors

2.3 各基因突變狀態與腫瘤組織學類型的關系普通型SBT組織中基因突變檢出率(73.9%)最高，其次為微乳頭型SBT(51.9%)，LGSC最低(35.7%)。SBT與LGSC間BRAF突變檢出率差異無統計學意義(P>0.05)。在KRAS突變亞型中，普通型SBT組織中G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*的檢出率明顯高于微乳頭型SBT和LGSC(P＜0.05)，而微乳頭型SBT組織中KRAS突變亞型G12S、G12D的檢出率高于普通型SBT和LGSC(P＜0.05)。KRAS突變亞型G13D僅在LGSC中被檢出，明顯高于普通型SBT和微乳頭型SBT(P＜0.05)，卵巢漿液性腫瘤中KRAS、BRAF突變類型詳見表1。此外，1例NRAS突變在LGSC中被檢出，2例PIK3CA突變分別在LGSC、微乳頭型SBT中被檢出。

表1 卵巢漿液性腫瘤中KRAS、BRAF突變分析[例(%)]Tab.1 Analysis of KRAS and BRAF mutations in ovarian serous tumors [n(%)]

2.4 各基因突變狀態與臨床病理特征的關系≤35歲患者的腫瘤組織中KRAS總突變率明顯高于>35歲者(P=0.027)，其中以G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*突變最突出，但差異無統計學意義(P=0.052)。KRAS突變亞型在不同腫瘤累及部位、TNM分期、腫瘤最大徑及淋巴結累及患者中差異無統計學意義(P>0.05)。BRAF突變常發生于≤35歲(P=0.030)或單側受累(P=0.015)的患者。所有BRAF突變均見于疾病早期階段的患者，且無淋巴結受累。BRAF突變在不同TNM分期、腫瘤最大徑及淋巴結累及患者中差異無統計學意義(P>0.05，表2)。NRAS、PIK3CA突變在不同臨床病理特征的患者中差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 卵巢漿液性腫瘤KRAS、BRAF突變與臨床病理特征的關系Tab.2 Relationship between KRAS and BRAF mutations and the clinicopathological features in ovarian serous tumors

2.5 ER、PR表達與腫瘤組織學類型的關系 64例標本中ER、PR的免疫組化平均得分分別為6.7分、7.2分，其中普通型SBT、微乳頭型SBT、LGSC中ER平均得分分別為6.7分、8.6分、3.0分，PR平均得分分別為8.4分、8.8分、2.4分。ER和PR陽性表達率均為76.6%(49/64、49/64)。免疫組化檢測結果顯示，普通型SBT、微乳頭型SBT中的ER、PR表達水平均明顯高于LGSC(P＜0.01或P＜0.001)，而普通型SBT與微乳頭型SBT間差異無統計學意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 卵巢漿液性腫瘤中ER、PR的表達情況Fig.2 Expression of ER and PR in ovarian serous tumors

2.6 各基因突變類型與ER、PR表達的關系 在36例基因突變組織中，ER、PR陽性表達率(均為86.1%)明顯高于陰性表達率(分別為13.9%、13.9%)。21例KRAS突變組織中，ER、PR陽性表達率分別為90.5%、85.7%，其中G12S、G12D突變中ER、PR陽性表達率均為38.1%，G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*突變中ER、PR陽性表達率均為47.6%，G13D突變中ER、PR陽性表達率分別為4.7%、0.0%。KRASG13D突變組織中PR陰性表達率明顯高于陽性表達率(P=0.014)(表3)。12例BRAF突變組織中，ER、PR陽性表達率分別為83.3%、91.7%；2例PIK3CA突變組織中，ER、PR陽性表達率均為50.0%；1例NRAS突變組織中，ER、PR陽性表達率均為100%。BRAF、NRAS、PIK3CA突變組織中的ER、PR陽性表達率差異均無統計學意義(P>0.05)。

表3 卵巢漿液性腫瘤KRAS突變亞型與ER、PR表達率的關系Tab.3 Association between KRAS mutant subtypes and ER and PR expression in ovarian serous tumors

3 討 論

EOC是一組異質性腫瘤，包括具有不同臨床病理和分子特征的各種惡性腫瘤，而漿液性卵巢腫瘤是其最常見的組織類型，因而需要更好地了解其分子基礎。影響細胞內信號轉導通路的致癌突變與癌變直接相關。RAS/RAF/MAPK和PI3K/AKT/mTOR通路是細胞內信號轉導中最重要的機制，因此，檢測卵巢漿液性腫瘤中KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF的突變狀況，有助于探索這些基因突變與癌變及臨床病理特征之間的關系。

在不同類型的癌癥中，KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF基因的突變頻率不同[13-15]。本研究發現普通型SBT的基因突變檢出率為73.9%(17/23)，其中39.1%(9/23)為KRAS突變、34.8%(8/23)為BRAF突變；微乳頭型SBT的基因突變檢出率為51.9%(14/27)，其中37.0%(10/27)為KRAS突變、3.7%(1/27)為PIK3CA突變、11.1%(3/27)為BRAF突變；LGSC的基因突變檢出率為35.7%(5/14)，其中14.3%(2/14)為KRAS突變、7.1%(1/14)為NRAS突變、7.1%(1/14)為PIK3CA突變、7.1%(1/14)為BRAF突變。由此可見，隨著疾病的進展，卵巢低級別漿液性腫瘤組織中BRAF、KRAF基因突變率逐漸下降，其中BRAF突變最明顯。BRAF、KRAS基因突變與卵巢漿液性腫瘤的組織學類型相關，SBT組織中基因突變率高于LGSC，且相對于BRAF基因突變，LGSC組織中KRAS基因突變更為常見。KRAS、NRAS和PIK3CA突變可能是LGSC的致癌驅動因子。

KRAS突變與SBT的浸潤性植入明顯相關，是腫瘤復發風險增高和患者生存率降低的重要預后指標[16]。Tsang等[17]發現，在未復發的SBT中BRAFV600E突變常見，而在復發的LGSC中KRAS基因突變更常見(>70%)，且帶有KRASG12V突變的患者總生存期較無該突變者縮短，這與Renaud等[18]的研究結果相似，后者發現存在KRASG12V突變的非小細胞肺癌患者表現出較差的總生存期和較高的復發率。Ohnishi等[19]基于Sanger測序發現，攜帶KRASG12D或G13D突變的黏液性交界性卵巢腫瘤可能更易進展為黏液性卵巢癌。另一項研究發現，與KRASG12V突變相比，具有KRASG12D突變的LGSC患者預后相對良好，但差異無統計學意義[20]。本研究發現，在普通型SBT和微乳頭型SBT組織中，KRAS基因總突變率相似(39.1%vs. 37.0%)，但突變亞型存在明顯差異：G12C、G12R*、G12V、G12A、G13C*突變更常見于普通型SBT(P＜0.05)，在LGSC中未被檢出；G12S、G12D突變多見于微乳頭型SBT(P＜0.05)，在LGSC中未被檢出；KRASG13D突變僅在2例LGSC中被檢出。KRAS突變亞型可能與患者的預后有關，但由于本研究納入病例不多，且缺乏跟蹤隨訪記錄，未能明確各突變亞型與患者預后的聯系，有待后續擴大樣本量進一步研究。

Malpica等[21]發現，含有SBT成分的卵巢漿液性囊腺瘤中可檢測到BRAF或KRAS突變，而在單純的漿液性囊腺瘤中未檢測出該突變。具有BRAFV600E突變的SBT進一步發展為漿液性癌的風險相對較低，且發生該突變的LGSC患者多處于疾病早期階段，晚期罕見[22-24]。Zeppernick等[25]發現，攜帶BRAF突變的SBT與細胞衰老相關的標志物p16和腫瘤抑制基因上調有關，患者預后較好。本研究結果顯示，BRAF基因突變僅見于疾病早期階段，12例SBT患者均為Ⅰ期，1例LGSC患者為Ⅱ期。此外，與微乳頭型SBT比較，普通型SBT組織中BRAF基因突變率明顯增高，而LGSC中則少見BRAF基因突變，這與Turashvili等[26]和Chui等[27]的報道一致，提示BRAF突變可能抑制了SBT向LGSC的進展。

本研究僅在1例Ⅲ期LGSC組織中檢測出NRAS外顯子2突變(7.1%)，提示NRAS突變率較低，且可能與疾病進展和患者不良預后有關。這與Xing等[28]的發現一致，后者在SBT中均未檢測出該突變(0/42)，僅在3.6%的LGSC中檢測出NRASQ61R突變(2/56)。Al-Qahtani等[29]發現，PIK3CA基因突變在EOC中的發生率較低(3.0%～12.8%)，可通過介導PI3K/AKT信號通路改變而引起惡變。此外，Al-Qahtani等[29]還發現，PIK3CA突變與患者年齡及不良預后呈正相關，且多見于SOC和子宮內膜癌。本研究在Ⅱ期LGSC和Ⅱc期微乳頭型SBT中各檢測出1例PIK3CA基因突變(7.1%、3.7%)，提示PIK3CA突變在漿液性卵巢癌的發生發展中可能起到一定作用，但仍有待后續擴大樣本量進一步明確。

據報道，LGSC的發病機制可能與女性激素有關[7]，與ER或PR陰性表達者相比，ER或PR陽性的SOC患者預后相對較好[30-31]。Ring等[32]通過查詢癌癥基因組圖譜和體外實驗發現，攜帶KRAS突變的腫瘤PR表達明顯降低(P=0.047)，攜帶KRAS突變的子宮內膜癌細胞中ERα和PR的表達明顯降低(P≤0.001)。結合本研究KRAS突變類型與腫瘤組織學類型和激素表達狀態之間的關系，提示隨著疾病的發展，KRAS突變類型可能發生改變，且攜帶G13D突變亞型的腫瘤中ER或PR陽性表達率明顯低于其他突變亞型，推測G13D突變可能通過某一途徑介導ER或PR低表達，但不排除受腫瘤組織學類型的影響所致。Vannucchi等[33]發現，在ERα或PR高表達的甲狀腺乳頭狀癌中，BRAFV600E突變的發生率較高。Liu等[34]發現，在ER或PR陽性表達的乳腺癌患者中，較高的BRAF/MEK通路活性與生存率更高有關。本研究結果顯示，BRAF突變組織中ER和PR陽性表達率分別為83.3%、91.7%，結合臨床病理資料，提示BRAF突變與ER、PR表達有關，攜帶該突變的患者預后較好。盡管在黑色素瘤中ERβ激動劑可抑制攜帶NRAS突變的癌細胞的增殖[35]，在不同ERα和PR表達狀態的乳腺癌中PIK3CA突變頻率存在明顯差異[36-37]，但本研究未發現NRAS或PIK3CA突變與ER或PR的表達狀態有關，這可能與樣本量不足有關。

本研究在KRAS、NRAS、PIK3CA和BRAF突變檢測中未發現交叉突變。KRAS、BRAF突變與患者的年齡、組織學類型有關。ER、PR高表達在SBT向LGSC發展過程中起抑制作用。KRAS突變可能是漿液性腫瘤的致癌驅動因子，在不同組織學類型中突變亞型存在明顯差異。KRASG13D突變與LGSC的關系較為突出，與PR陰性表達也明顯相關，是LGSC的重要致癌基因，可能成為預測患者預后的重要指標，但仍有待進一步研究。BRAF突變具有兩面性，一方面在疾病早期階段促進腫瘤的發生，另一方面又可阻礙SBT向LGSC的進一步發展。NRAS突變僅發生于少數的LGSC。NRAS、PIK3CA突變在漿液性卵巢癌的發生發展中起重要作用，但由于樣本量有限，未發現有統計學意義的結果，有待擴大樣本量進一步明確。卵巢漿液性腫瘤患者進行KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF突變檢測可以為臨床診治、預后評估提供指導。