基于TGF-β1/Smads/ACTA2信號通路探討豬食管ESD環切術后狹窄模型人工潰瘍纖維化的機制

周鑫，馬丹，付娟，王云鋒，蘇勝昌，唐祖鑫，李曉渝，陳潔,*，李志*

1西南醫科大學中西醫結合學院，四川瀘州 646000；2西南醫科大學附屬中醫醫院脾胃病科，四川瀘州 646000；3海軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，上海 200082

內鏡黏膜下剝離術(endoscopic submucosal dissection，ESD)是治療累及黏膜、黏膜下層的早期食管癌及癌前病變的主要措施之一，能有效地整塊切除直徑>2 cm的病灶[1]。人工潰瘍部位狹窄是ESD術后最嚴重的并發癥之一，當病變范圍累及食管全周時，食管狹窄的發生率接近100%[2]，嚴重影響術后生活質量。有研究發現，食管ESD環切術后狹窄部位肌成纖維細胞(myofibroblasts，MFB)標志蛋白——α肌動蛋白2(actin alpha 2，ACTA2)的表達明顯上調，提示食管ESD環切術后狹窄可能與人工潰瘍過度纖維化有關[3]。人體食管組織可取材部位有限，誘導食管過度纖維化的上游機制尚不明確，本研究建立豬食管ESD環切術后狹窄模型，以探討人工潰瘍過度纖維化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8頭普通級健康雄性實驗白豬，體重(15.5±0.9) kg，購自上海市甲干生物科技有限公司[動物許可證號：SCXK(滬)2015-0005]。

1.2 試劑 注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(舒泰?50，批號：6477)購自維克中國公司，硫酸阿托品注射液(批號：040191511)購自山西省芮城科龍獸藥有限公司，PrimeScriptTMRT反應混合物(批號：RR036Q)、TB Green?Premix EX TapTMⅡ(批號：RR820A)購自日本TAKARA公司，BCA蛋白定量試劑盒(批號：ZJ102)購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司，轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)抗體(批號：NBP1-80289)購自美國NOVUS公司，共介導Smad蛋白2/共介導Smad蛋白3(Smad2/3)抗體(批號：#8685)購自美國CST公司，p-Smad2/3抗體(批號：D160746)購自美國Affinity公司，Smad4抗體(批號：D220124)、Smad7抗體(批號：D160746)購自上海生工生物工程股份有限公司，結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體(批號：23936-1-AP)、ACTA2抗體(批號：80008-1-RR)購自美國Proteintech公司，山羊抗兔IgG(批號：L3012)購自美國SAB公司。

1.3 儀器 TP1020石蠟組織包埋機、RM2235石蠟切片機購自德國LEICA公司；SpectraMax SM0260全自動酶標儀購自美國Molecular Devices公司；AXIO Scope A1光學顯微鏡購自德國ZEISS公司；Wonbio-48R高通量組織研磨儀購自上海Onebio Biotech公司，LightCycler 480實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組與動物模型制備 將實驗白豬適應性飼養1周后，隨機均分為假手術組與模型組(n=4)。所有動物術前禁食24 h，禁水6 h。麻醉誘導前15 min肌內注射硫酸阿托品(0.05 mg/kg)抑制腺體分泌，隨后肌內注射舒泰?50(10 mg/kg)誘導麻醉。麻醉后模型組給予氣管插管，術中吸入1%～2%異氟烷維持麻醉深度，假手術組給予面罩吸氧。所有內鏡操作過程中均使用心電圖監測器觀察白豬的生命體征。

實驗白豬取左側臥位，由經驗豐富的消化內鏡副主任醫師用帶有透明帽(ND-201-1802，Olympus公司)的上消化道內鏡(GIF-Q260J，Olympus公司)進行操作，均已排除可能干擾本研究結果的食管病變。模型組采用“隧道法”，通過黏膜下注射分離黏膜層與固有肌層，在距離賁門10～14 cm處使用Dual刀(KD-650L，Olympus公司)進行人工潰瘍顱側及尾側的圓周標記，先沿尾側標記切開黏膜，再沿顱側標記建立黏膜下隧道，然后逐漸與尾側切口連接，聯合使用Dual刀及IT-2刀(KD-611L，Olympus公司)完成黏膜下剝離。假手術組僅用帶有透明帽的上消化道內鏡輕觸賁門上10～14 cm處的食管黏膜數次。實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規定。

內鏡操作結束后，將動物轉移至安靜溫暖處，采用血氧飽和度監測儀觀察生命體征直至麻醉蘇醒。兩組術后均禁食24 h，先給予流質飲食，再逐漸過渡至固體飲食，當模型組出現進食困難時，兩組均切換為流質飲食。模型組造模后連續3 d肌內注射氨芐西林20 mg/(kg·d)抗炎，連續7 d喂服奧美拉唑10 mg/d抑酸。

1.4.2 標本采集 造模后間隔7 d行1次食管內鏡檢查，第3周模型組動物食管人工潰瘍部位已明顯狹窄且內鏡不能通過，提示造模成功(圖1)。處死動物后分別沿顱側、尾側橫軸采集模型組食管人工潰瘍部位組織，假手術組采集與模型組對應長度的食管組織。取部分組織全層于4%多聚甲醛中固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋。剩余組織剔除固有肌層及外膜后，于-80 ℃保存。

圖1 兩組實驗白豬造模后第3周內鏡下食管形態Fig.1 Endoscopic esophageal morphology of each group of tested pigs at 3rd week after endoscopic mucosal dissection

1.4.3 HE染色 組織蠟塊經切片、脫水、復水后，蘇木精染色5 min，水洗，再于1%鹽酸乙醇中分色5 s，自來水沖洗15 min，甩干，75%乙醇處理10 s后，直接置于1%醇溶性伊紅染色1 min，水洗，無水乙醇脫水2 min，晾干，再以二甲苯透明10 min后，于通風處晾干，中性快干片封片。采用Image J圖像處理軟件對兩組食管黏膜下層的成纖維細胞(fibroblasts，FB)與肌成纖維細胞(muscle fibroblasts，MFB)進行半定量分析(每張切片隨機挑選5個視野)，以細胞總個數/細胞總面積為最終測定結果。

1.4.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測相關基因mRNA的表達 稱取100 mg食管組織，用高通量組織研磨儀研磨。采用Trizol法，依次加入Trizol、氯仿、異丙醇、75%乙醇提取總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書分別反轉錄為cDNA，反轉錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，保持4 ℃。參照Green?Premix EX TapTMⅡ試劑盒說明書進行qRT-PCR檢測，擴增引物見表1。擴增條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火，延伸30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法分析mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qRT-PCR

1.4.5 免疫組化檢測CTGF、ACTA2的表達 組織蠟塊經切片、脫水、復水、枸櫞酸100 ℃水浴修復抗原、過氧化物酶阻斷、封閉、CTGF及ACTA2一抗及相應種屬的二抗孵育、顯色、蘇木精復染、鹽酸乙醇分色、脫水、封片，在光鏡下觀察CTGF、ACTA2的表達情況。使用Image-Pro Plus圖像處理軟件對陽性結果行半定量分析(每張切片隨機挑選5個視野)，結果采用平均光密度值表示(目的蛋白光密度值/圖像面積)。

1.4.6 Western blotting檢測TGF-β1/Smads/ACTA2信號通路相關蛋白的表達 取-80 ℃保存的100 mg食管組織，加入1 ml含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，采用組織研磨儀研磨后于冰上裂解30 min，渦旋振蕩數次，15 000 r/min離心15 min；吸取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加入SDS上樣緩沖液，于100 ℃干熱塊上加熱7 min使蛋白變性，微量離心2 min后于-80 ℃保存。蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜上，室溫封閉2 h，TGF-β1(1:1000)、Smad2/3(1:1000)、p-Smad2/3(1:1000)、Smad4(1:500)、Smad7(1:1000)、CTGF(1:1000)、ACTA2(1:5000)

一抗按比例稀釋后，置于搖床上4 ℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育60 min，洗膜，顯色，每組重復4次。采用凝膠圖像分析成像系統進行條帶檢測，采用Image J圖像處理軟件對條帶灰度值進行半定量分析，結果以目的蛋白與內參蛋白的相對表達量表示。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 食管組織HE染色 模型組食管人工潰瘍部位復層鱗狀上皮層變薄，再生上皮在人工潰瘍部位不能連續分布；黏膜肌層缺失；黏膜下層新生的結締組織增厚、致密，可見大量炎性細胞浸潤。與假手術組比較，模型組FB/MFB大量增殖(14.992±0.291vs.28.510±0.612，P＜0.001)。FB形態呈多角形或扁平星形，細胞質染色較淺，細胞核大且呈規則卵圓形，核內可見細小黑色斑點，呈方向一致地束狀排列。MFB呈長梭形，細胞核扁圓，與細胞外間質連接緊密，呈波浪形平行排列。假手術組食管組織黏膜層及黏膜下層完整，結締組織疏松，內含少量排列雜亂的纖維細胞，除血管壁外幾乎無MFB分布(圖2)。

圖2 兩組實驗白豬食管組織形態Fig.2 Morphology of esophageal tissues in each group of tested pigs

2.2 qRT-PCR檢測食管組織TGF-β1、Smad2、Smad3、ACTA2mRNA的表達 與假手術組比較，模型組食管組織TGF-β1、Smad2、Smad3、ACTA2的mRNA表達均明顯上調(P＜0.05，圖3)。

圖3 qRT-PCR檢測兩組食管組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、ACTA2 mRNA的表達Fig.3 Relative expression levels of TGF-β1, Smad2, Smad3,and ACTA2 mRNA in each group of esophageal tissues of tested pigs (qRT-PCR)

2.3 食管組織TGF-β1/Smads/ACTA2信號通路相關蛋白的表達

2.3.1 免疫組化檢測CTGF、ACTA2表達 CTGF蛋白在模型組食管人工潰瘍部位組織中的陽性表達升高，致密纖維組織中FB的細胞質可見黃色或棕褐色顆粒沉積；假手術組僅疏松結締組織中纖維細胞的細胞質有少量CTGF蛋白表達。ACTA2蛋白在模型組增生纖維層MFB的細胞質中表達增強，部分細胞核可見表達，呈黃色或棕褐色平行的波浪形分布；而在假手術組的疏松結締組織中僅血管壁肌細胞可見ACTA2陽性表達，在疏松結締組織中的纖維細胞幾乎不表達(圖4)。對免疫組化染色結果進行半定量分析顯示，模型組中CTGF、ACTA2的陽性表達水平均高于假手術組(P＜0.001，表2)。

圖4 CTGF、ACTA2蛋白在實驗白豬食管組織中的表達(免疫組化)Fig.4 The positive expression of CTGF and ACTA2 protein in esophageal tissue of tested pigs (Immunohistochemistry)

表2 實驗白豬食管組織CTGF、ACTA2蛋白陽性表達半定量分析(平均光密度值，±s，n=4)Tab.2 Semi-quantitative analysis of positive expression of CTGF and ACTA2 protein in esophageal tissues of each group of tested pigs (average optical density value, ±s, n=4)

表2 實驗白豬食管組織CTGF、ACTA2蛋白陽性表達半定量分析(平均光密度值，±s，n=4)Tab.2 Semi-quantitative analysis of positive expression of CTGF and ACTA2 protein in esophageal tissues of each group of tested pigs (average optical density value, ±s, n=4)

CTGF. 結締組織生長因子；ACTA2. α-肌動蛋白-2

組別 CTGF ACTA2假手術組 0.017±0.003 0.021±0.002模型組 0.082±0.004 0.047±0.003 t 12.823 7.642 P＜0.001 ＜0.001

2.3.2 Western bloはing檢測TGF-β1及其下游蛋白的表達 與假手術組比較，模型組TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad4、Smad7、CTGF、ACTA2蛋白表達均明顯上調(P＜0.05，圖5)。

圖5 實驗白豬食管組織TGF-β1/Smads/ACTA2信號通路相關蛋白的表達(Western blotting)Fig.5 Expression of TGF-β1/Smads/ACTA2 related proteins in esophageal tissues of each group of tested pigs (Western blotting)

3 討 論

我國是世界上食管癌發病人數最多的國家之一，2015年食管癌新發病例數為24.6萬例，占全球發病人數的50%以上，并呈逐年上升趨勢[4-6]。2012年、2017年日本食管協會發布的食管癌診療指南指出，食管切除范圍不再是限制其內鏡下治療的禁忌證[7-8]，意味著ESD在食管癌診療中的應用將越來越廣泛，但與此同時ESD相關并發癥的發生率也將隨之升高，食管狹窄就是其中之一。研究表明，食管ESD術后人工潰瘍面積是狹窄發生的獨立危險因素，且治療范圍越大，病變縱徑越長，術后食管狹窄發生的風險就越高，當病變范圍>3/4食管周徑、病變縱徑>5 cm時，極易出現頑固性食管狹窄，使患者術后生活質量嚴重降低[2,9]。因此，對食管ESD環切術后人工潰瘍纖維化修復的機制研究變得尤為迫切。

本研究通過食管ESD環切術建立縱向約4 cm的人工潰瘍，在術后第3周左右，模型組實驗白豬半流質飲食進食困難，甚至有嘔吐癥狀，電子胃鏡檢查提示人工潰瘍部位出現明顯狹窄，且直徑為9.8 mm的內鏡不能通過時，定義為造模成功，與Nonaka等[10]的研究結果基本吻合。從食管黏膜缺損愈合的時間進程來看，模型組白豬在食管ESD環切術后3周左右可形成明顯狹窄。

TGF-β超家族在調節細胞生長、增殖、分化等方面有重要意義[11]，其中TGF-β1是一種來源廣泛的關鍵致纖維化細胞因子，多種細胞(如FB、肝星狀細胞、內皮細胞等)均可分泌TGF-β1[12]。當機體受到損傷時，多種細胞會分泌大量TGF-β1，通過調節Smad2/3蛋白磷酸化水平激活Smads信號通路，在共同介導蛋白Smad4的作用下，進一步與活化的轉化生長因子-β1受體(transforming growth factor β receptor-Ⅰ，TβR-Ⅰ)結合，向細胞核傳遞相應的轉錄信號，激活轉錄因子，調節FB的增殖及分化，故TGF-β1又稱為組織器官纖維化的“啟動子”。Smad7是Smads信號轉導通路的抑制性蛋白，通過競爭性地與活化的TβR-Ⅰ結合，使Smad2/3去磷酸化而失活，可以從側面反映Smads通路的信號轉導水平[13]。纖維化相關研究結果顯示，TGF-β1拮抗劑可以抑制Smad2/3磷酸化，從而下調TGF-β1/Smads信號通路相關蛋白的表達，進而抑制FB的增殖[14]。Tang等[3]的研究表明，食管狹窄模型動物的血清TGF-β1水平明顯升高，且與狹窄程度呈正相關。

本研究結果顯示，無論在基因水平還是蛋白水平，模型組TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3的表達均上調；Western blotting結果進一步提示，作為Smads信號轉導的共介導蛋白之一，模型組Smad4的表達亦高于假手術組；抑制性蛋白Smad7的表達升高，可競爭性地與活化受體結合，促進Smad2/3的去磷酸化，從側面反映出該通路的活化水平提高，這與現有的研究結果基本吻合[15]。因此，食管ESD環切術后人工潰瘍部位管腔狹窄可能與組織損傷后多種細胞分泌TGF-β1增多及Smads信號通路過度活化有關。

CTGF是一類富含半胱氨酸的生長因子家族，具有明顯的絲裂原性及趨化性，可調節多種類型細胞的黏附、遷移、增殖、存活及分化，在組織纖維化過程中發揮了重要作用[16]。Arias等[17]在纖維化體外實驗中證實，CTGF啟動子序列上存在TGF-β誘導CTGF所必需的功能性Smads結合位點，CTGF可能是TGF-β1/Smads信號轉導通路的直接下游效應介質之一。Mori等[18]在小鼠皮膚纖維化模型中發現CTGF的持續表達是纖維化緩慢持續進展的重要環節之一。ACTA2是MFB的標志性蛋白之一，可以反映MFB的分化活性。有研究證實，CTGF與TGF-β1發揮協同作用，誘導腎小管上皮細胞發生表型轉化，上調間質細胞中ACTA2的表達，促進腎臟間質中的FB轉化為MFB[19]。Nonaka等[10]發現食管狹窄的特征性病理改變之一是大量MFB平行排列，水平延伸，從而促進凸起的管腔嵴形成。因此在纖維化病程中，CTGF是TGF-β1/Smads信號轉導的關鍵下游效應靶點，可能與TGF-β1發揮協同作用，上調ACTA2的表達，促進纖維化持續進展，誘導FB向MFB表型轉化。本研究結果顯示，模型組ACTA2mRNA表達上調，CTGF、ACTA2蛋白表達明顯高于假手術組，表明CTGF可能在TGF-β1/Smads轉導通路的誘導下，上調功能性Smads位點結合水平，從而參與食管ESD環切術后人工潰瘍部位過度纖維化的進程，促進FB增殖，并誘導其向MFB表型轉化。但本研究對模型的觀察周期僅為3周，尚不清楚相關蛋白在長期食管纖維化進展中的表達情況。

綜上所述，本研究再次驗證了豬食管ESD環切術后3周左右可形成食管狹窄；造模后人工潰瘍部位多種細胞大量分泌TGF-β1，隨后上調Smad2/3的磷酸化及核轉位水平，促進Smads信號轉導通路的進一步活化，以及下游轉錄介質CTGF的表達，從而上調細胞內ACTA2的表達，造成FB大量增殖并逐漸分化為MFB，并最終形成食管ESD環切術后狹窄。TGF-β1/Smads/ACTA2信號通路的過度活化可能是食管ESD環切術后人工潰瘍過度纖維化修復的機制之一。