基于生物信息學篩選通過調控脂肪細胞功能改善肥胖的中藥單體

李暢，冷清陽，冷華卿，張宏利，李曉華*

1上海中醫藥大學第七人民醫院內分泌科，上海 200137；2上海市黃浦區打浦橋街道社區衛生服務中心，上海 200032

肥胖是長期能量攝入與消耗不平衡引起的以體內脂質過度蓄積、體重指數超過一定范圍為特征的慢性代謝性疾病，可增加罹患心血管疾病、2型糖尿病等的風險[1-4]，嚴重影響生活質量。迄今為止，治療肥胖主要是采用生活方式管理、藥物降脂、減肥手術等策略，但尚不能滿足臨床需求。減重手術雖然可通過改善患者的脂肪組織功能、增加胰島素敏感性、降低炎癥水平而改善代謝[5]，但存在術后并發癥等問題。本研究基于基因表達綜合數據庫(gene expression omnibus，GEO)，運用生物信息學手段分析差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)和核心(hub)基因，并通過藥物基因組數據庫(connectivity map，cMAP)預測及鑒定可調節脂肪細胞功能的中藥單體，旨在為肥胖治療提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

1.1.1 GEO芯片數據下載及處理 通過在GEO數據庫中分別檢索“BMI AND subcutaneous adipose tissue”和“bariatric surgery AND subcutaneous adipose tissue”，可得到GSE70353[6]和GSE72158[7]兩個數據集的探針矩陣。數據集GSE70353含770名不同BMI的男性(45～73歲)皮下白色脂肪組織(subcutaneous adipose tissue，SAT)的基因表達，篩選出其中110名肥胖者[體重指數(BMI)>30 kg/m2]及259名非肥胖者(BMI＜25 kg/m2)的數據；數據集GSE72158含42例女性減肥術前及術后1年SAT的基因表達。這兩個數據集的詳細信息見表1。利用perl腳本將探針轉換為基因名，將矩陣數據分組合并。

表1 數據集基礎指標信息Tab.1 Detail for the GEO data sets

1.1.2 差異基因的篩選 通過R軟件(4.11版)對探針矩陣進行標準化，運行limma包篩選出DEGs(|log2(fold change)|>0.5，Padjust＜0.05)，隨后繪制DEGs火山圖。整理數據，利用R軟件讀取兩個數據集各自對應DEGs的基因名稱，去掉基因首尾空格，基因取唯一，引用Venn包對交集基因進行繪圖。

1.1.3 DEGs的GO功能富集和KEGG通路富集分析 通過R軟件(4.11版)讀取兩個數據集中篩選出來的共同DEGs，通過安裝或引用DOSE、clusterProfiler、org. Hs. eg. db、enrichplot對共同的DEGs進行功能注釋Gene Ontology(GO)富集分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析(Padjust＜0.05)，并篩選出前20個富集功能和通路。GO分析包括生物學過程(biological process，BP)、細胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)分析。

1.1.4 蛋白質互作網絡(PPI)的構建和hub基因的篩選 將共同的DEGs導入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)，獲得蛋白質PPI后，設置高度置信(high confidence)=0.7，隱藏無鏈接的單個節點。將PPI篩選出的基因導入Cytoscape(3.8.2版)，利用CytoNCA包選取度中心性(degree)為中位值至最大值之間，篩選出hub基因。

1.1.5 小分子中藥單體篩選 使用cMAP分別讀取hub基因的上調組及下調組基因，并預測可靶向這些基因的小分子藥物。

1.2 細胞實驗

1.2.1 實驗材料 小鼠3 T 3-L 1 細胞系購自ATCC細胞庫。巖白菜素、銀杏內酯A購自美國MedChemExpress公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清、PBS購自美國Gibco公司；胰島素購自美國Lilly公司；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、二甲基亞砜(DMSO)、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；PCR引物購自上海生物工程有限公司；反轉錄、qRT-PCR試劑盒購自南京諾唯贊公司；牛血清白蛋白購自新西蘭Proliant生物公司。

1.2.2 3T3-L1白色脂肪細胞的培養和誘導分化將3T3-L1前脂肪細胞接種于24孔板，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基培養于37 ℃、5%CO2培養箱中。細胞完全融合后采用含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μg/ml胰島素的完全培養基誘導至細胞完全收縮，采用含10 μg/ml胰島素的完全培養基培養48 h后換成不含胰島素的完全培養基，每2 d更換一次培養基。誘導分化的第8天，3T3-L1誘導的成熟白色脂肪細胞(white adipocytes，WAT)即可用于后續實驗。

1.2.3 細胞分組與處理 采用含2%牛血清白蛋白的DMEM高糖培養基饑餓6 h后，將細胞分別加入含終濃度為0、0.4、2和10 μmol/L巖白菜素的培養基和含終濃度為0、0.01、0.1和1 μmol/L銀杏內酯A的培養基內處理24 h。獨立細胞實驗至少重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR 使用Trizol試劑提取白色脂肪細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，將cDNA稀釋10倍后作為模板，采用qRT-PCR檢測相關基因的mRNA表達情況。引物序列如下：腫瘤壞死因子α(TNF-α)，上游5'-TGGGCCTCTCATGCACCACC-3'，下游5'-GAGGCAACCTGACCACTCTCCCT-3'；白細胞介素6(IL-6)，上游5'-AGACAAAGCCAGAGTCCT TCAG-3'，下游5'-GCCACTCCTTCTGTGACTCCAG-3'；過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)，上游5'-TCGCTGATGCACTGCCTATG-3'，下游5'-GA GAGGTCCACAGAGCTGATT-3'；核糖體蛋白基(36B4)，上游5'-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCT-3'，下游5'-CCGCAGGGGCAGCAGTGGT-3'。以36B4作為內參基因，計算2-ΔΔCt值比較基因的相對表達量。

1.3 統計學處理 采用Graph Pad Prism 8.0進行統計分析。所有數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩數據庫中與改善肥胖相關的共表達DEGs的篩選 GSE70353數據集中含有770名不同BMI男性(45～73歲)SAT的基因表達數據，篩選出259名非肥胖者(BMI＜25 kg/m2)與110名肥胖者(BMI>30 kg/m2)的132個DEGs用于后續研究，其中上調基因59個，下調基因73個(圖1A)；GSE72158數據集中含有42例減肥手術前及術后1年女性患者SAT的基因表達數據，篩選出291個DEGs用于后續研究，其中上調基因76個，下調基因215個(圖1B)。這兩個數據集有64個共同的DEGs，其中，減肥手術改善肥胖后SAT中有19個基因(與肥胖呈負相關)上調，45個基因(與肥胖呈正相關)下調(圖1C、D，表2)，這些基因將用于后續分析。

表2 兩個數據集中的共表達差異基因(DEGs)Tab.2 Co-expressed DEGs in two data sets

圖1 兩個數據集共表達的差異表達基因(DEGs)的篩選Fig.1 Identification of co-expressed DEGs from two data sets

2.2 共表達DEGs的GO富集分析 GO富集分析中的BP分析結果顯示，共表達DEGs主要在中性粒細胞趨化性(neutrophil chemotaxis)、參與免疫反應的中性粒細胞活化(neutrophil activation involved in immune response)、中性粒細胞介導的免疫(neutrophil mediated immunity)、體液免疫反應(humoral immune response)等子集中富集；CC分析結果顯示，共表達DEGs主要在特殊顆粒(specific granule)、分泌顆粒膜(secretory granule membrane)、低密度脂蛋白顆粒(low-density lipoprotein particle)等子集中富集；MF分析結果顯示，共表達DEGs主要定位在細胞因子活性(cytokine activity)、趨化因子活性(chemokine activity)、CCR趨化因子受體結合(CCR chemokine receptor binding)、整理素結合(integrin binding)、趨化因子受體結合(chemokine receptor binding)等子集(圖2)。

圖2 共表達差異表達基因(DEGs)的GO富集分析Fig.2 GO enrichment results of co-expressed DEGs

2.3 共表達DEGs的KEGG富集分析 KEGG通路分析結果顯示，共表達的DEGs主要與補體和凝血級聯反應(complement and coagulation cascades)、百日咳(pertussis)、內分泌抵抗(endocrine resistance)等通路有關，此外還與金黃色葡萄球菌感染(Staphylococcus aureusinfection)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、酒精性肝病(alcoholic liver disease)等通路有關(圖3)。

圖3 共表達差異表達基因(DEGs)的KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis of co-expressed DEGs

2.4 PPI的構建與hub基因的鑒定 通過STRING構建64個DEGs的PPI(圖4A)，篩選出高度置信(high confidence=0.7)且隱藏無節點的基因后，利用Cytoscape篩選Degree中位值(2)至最大值(12)之間的基因，共得到18個hub基因(圖4B、表3)，其中肥胖改善后下調的基因有17個(與肥胖呈正相關)，僅APOB基因上調(與肥胖呈負相關)。

表3 共表達基因中的18個核心(hub)基因Tab.3 Eighteen hub genes from co-expressed DEGs

圖4 兩個數據集共表達差異表達基因(DEGs)的PPI圖(A)及hub基因網絡圖(B，黃色為上調基因、橙色為下調基因)Fig.4 The PPI network (A) and hub genes (B, the yellow is up-regulated gene and the orange is down-regulated gene) of coexpressed DEGs in two data sets

2.5 中藥單體的預測 通過cMAP分析上調及下調的hub基因，篩選出1309個小分子藥物，選擇顯著富集(P＜0.05)的藥物，得到1264個小分子藥物，其中中藥提取物74個。去除有毒或不宜長期內服的藥物后，最終獲得28個中藥單體。其中22個已被證實可明顯降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體重或通過其他機制改善肥胖；尚無研究表明其余6個中藥單體(北美黃連堿、荷包牡丹堿、巖白菜素、表長春胺、銀杏內酯A、長春胺)與肥胖有關(表4)。

表4 cMAP數據庫中篩選出的中藥單體Tab.4 Traditional Chinese medicines (TCM) monomers screened from cMAP

2.6 初步驗證篩選出的部分中藥單體改善肥胖的作用 qPCR實驗結果顯示，與0 μmol/L組比較，0.4 μmol/L巖白菜素組PPARγmRNA表達水平明顯下降(P＜0.05)，2 μmol/L和10 μmol/L巖白菜素組PPARγmRNA表達水平有下調的趨勢，但差異無統計學意義(圖5A)；0.4 μmol/L和10 μmol/L巖白菜素組IL-6mRNA表達水平明顯下降(P＜0.05)，2 μmol/L巖白菜素組IL-6mRNA表達水平有下調的趨勢，但差異無統計學意義(圖5A)。與0 μmol/L組比較，0.1 μmol/L銀杏內酯A組PPARγmRNA表達水平明顯下降(P＜0.05)，0.01 μmol/L和1 μmol/L銀杏內酯A組PPARγmRNA表達水平有下調的趨勢，但差異無統計學意義(圖5B)；0.1 μmol/L銀杏內酯A組IL-6mRNA表達水平明顯下降(P＜0.05)，0.01 μmol/L和1 μmol/L銀杏內酯A組IL-6mRNA表達水平有下調的趨勢，但差異無統計學意義(圖5B)。

圖5 中藥單體對3T3-L1細胞誘導分化的WAT中PPARγ、IL-6 mRNA表達水平的影響Fig.5 Effects of TCM monomer on the expression of PPARγ and IL-6 mRNA in WAT induced by 3T3-L1 cells

3 討 論

肥胖是多種疾病的危險因素，如未能及時控制，將嚴重影響患者的生活質量，且目前仍無令人滿意的治療措施。有研究發現，減重手術可改善患者的脂肪組織功能、增加胰島素敏感性、緩解炎癥等[5]。本研究的生物信息學分析也發現，減肥手術后，促進肥胖的促炎狀態向抗炎狀態轉變，這或許是減肥手術后脂肪細胞功能改善的關鍵之處。但由于減肥手術標準嚴格[30]、并發癥多，適用人群不夠廣泛，本研究試圖找到其他可改善脂肪細胞功能的藥物，如中藥單體。

本研究通過GEO數據庫中的兩個數據集分別篩選出肥胖人群向非肥胖人群轉化后的DEGs，以及經減肥手術治療前后患者的DEGs，并確定了64個共同的DEGs，GO富集分析發現這64個DEGs主要與炎癥相關，與之前的文獻報道一致[31]。其中下調的45個基因主要與中性粒細胞介導的免疫反應和體液免疫等生物學過程有關，提示減肥手術緩解了肥胖引起的脂肪組織炎癥。此外，這64個DEGs多位于分泌顆粒、特定的顆粒及低密度脂蛋白顆粒中，分子功能多與炎癥趨化因子活動相關。KEGG通路分析結果顯示，下調的DEGs多與補體和凝血級聯反應及內分泌代謝等通路有關。

本研究進一步對64個DEGs構建PPI網絡，篩選出18個hub基因。ACP5作為脂肪組織巨噬細胞的標志物，可編碼酒石酸抗性酸磷酸酶，后者在小鼠中過表達后表現為增生性肥胖，并可促進前脂肪細胞進入細胞增殖周期[32]。MMP9作為巨噬細胞活化標志物，可通過參與脂肪組織的細胞外間質重構來應對脂肪組織的擴張[33]，但目前尚不明確其是否對脂肪細胞本身的功能具有調節作用。脂肪組織中免疫球蛋白FCER1G，補體蛋白家族的C1QB、C1QC，補體受體VSIG4，趨化因子CCL2及配體蛋白TYROB均與免疫有關；SPP1是可上調ITF-γ和IL-12表達的細胞因子，與肥胖呈正相關[34]，提示此類hub基因可能在調節脂肪組織炎癥中發揮一定作用，但仍需進一步證實。本研究篩選出的hub基因并非常見的脂肪細胞炎癥標志物，但可作為觀察肥胖是否改善的伴隨指標。

本研究在cMAP平臺篩選出同樣調控這18個hub基因的小分子藥物，有1309個小分子藥物作用后可觀察到這些hub基因的相應變化，而最終篩選得到28個無明顯不良反應且適合口服的中藥單體，其中的22個中藥單體已被證實能夠減重或通過其他方式改善肥胖。這22個中藥單體中，不乏熟知的抗肥胖藥物(如小檗堿、雷公藤紅素、兒茶素、辣椒素、熊果酸、青蒿素及其衍生物等)和近年才發現的抗肥胖藥物(如楊梅素、白樺脂酸、白楊素、槭樹素、橘皮苷等)，提示本研究方法預測出的藥物可靠性高。

另6個中藥單體尚無報道提示其可改善肥胖。有研究發現，巖白菜素可下調間充質干細胞中的脂肪細胞特異性標志物PPARγ[2]，銀杏內酯A可抑制骨髓基質細胞的成脂分化[3]，而肥胖的外在表現形式是白色脂肪組織過度積累。絕大多數脂肪細胞在分化狀態與未分化的前體狀態之間循環[1]，故抑制脂肪細胞分化是改善肥胖的一種途徑。因此，筆者猜測巖白菜素和銀杏內酯A或許可通過抑制白色脂肪分化而改善肥胖，并利用3T3-L1細胞誘導分化的WAT模型進行驗證；此外，hub基因主要與炎癥相關，推測這兩個中藥單體可緩解炎癥反應。因篩選出的hub基因在肥胖中的作用機制尚不明確，故本研究選擇了與肥胖炎癥相關的標志物IL-6進行驗證。在細胞水平上，本研究初步證實巖白菜素和銀杏內酯A可下調WAT中炎性因子IL-6、脂肪細胞分化標志物PPARγmRNA的表達，提示巖白菜素和銀杏內酯A可能具有通過調控脂肪細胞而改善炎癥，以及抑制脂肪細胞分化的作用，進一步證實了此篩選方法的可靠性。但巖白菜素和銀杏內酯A是否還通過其他作用機制改善肥胖，仍有待進一步驗證。尚無研究發現另外4個中藥單體與肥胖相關，但是cMAP數據庫提示其可靶向與炎癥相關的hub基因，因此，筆者猜測這4個中藥單體也可能通過改善炎癥而發揮改善肥胖的作用，后續將進一步明確其是否可調節炎癥水平，并對其改善肥胖的作用和機制進行深入探討。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析預測可能調控脂肪細胞功能改善肥胖的中藥單體，共篩選出28個中藥單體，其中22個已被證實可改善肥胖，仍有6個中藥單體未被證實具有改善肥胖的作用。本研究初步證實2個中藥單體(巖白菜素和銀杏內酯A)可能改善肥胖，表明此研究方法篩選的藥物可靠，為后續尋找和開發治療肥胖的藥物提供了新思路，另外4個中藥單體的作用則仍有待進一步研究證實。