川貝母對卵清蛋白致敏哮喘小鼠的作用及其機制

侯從嶺，蘆曉帆，雷小婷，唐引引，趙潤楊，李彬

河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院肺病科，河南鄭州 450002

支氣管哮喘是最常見的慢性氣道炎癥之一，其典型癥狀為持續性發作的氣促、喘息、咳嗽和胸悶等[1]。哮喘致死率較高，其發病率在全球氣道慢性疾病中居首位[2]。哮喘發作是氣道狹窄的結果，氣道狹窄可引起支氣管腫脹、分泌物增加和肌肉收縮等。支氣管哮喘發作通常由致敏原引起[3]，常見誘因包括過敏原(如煙草、花粉等)、氣溫變化和壓力等。哮喘是由多種免疫細胞特別是T細胞引起的慢性氣道炎癥，其與輔助性T細胞1(T helper type1，Th1)/輔助性T細胞2(T helper type 2，Th2)及其分泌的細胞因子失衡密切相關[4]。Th2通過釋放Th2型細胞因子如白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)等，啟動過敏性哮喘的免疫應答；而Th1通過釋放Th1型細胞因子如γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)等，參與拮抗Th2細胞反應，抑制過敏性哮喘的進展[5]。因此，靶向調節Th1/Th2的平衡有助于從源頭上緩解過敏性哮喘。另有研究發現，Janus激酶3(Janus kinase 3，JAK3)/信號轉導和轉錄激活子(signal transducer and activator of transcription，STAT)信號傳導途徑與哮喘進程中Th1/Th2平衡調節相關[6-7]。Th2合成的炎性介質是JAK/STAT6通路的上游刺激因子，可誘導STAT6磷酸化，STAT6磷酸化參與杯狀細胞化生，從而導致黏液分泌過多[8-9]。目前研究發現，多種天然中草藥及中草藥成分可通過調節そ1/そ2失衡治療哮喘，如茯苓和人參皂苷等[10-11]。川貝母(Fritillaria cirrhosaD. Don)是一種多年生的百合科草本植物，具有清熱化痰、潤肺止咳、散結消腫的功效，以及降低血壓和控制血糖的作用。有報道稱，川貝母可減輕哮喘模型小鼠的氣道炎癥[12]，但其作用機制尚未完全闡明。值得注意的是，川貝母水提物可上調STAT家族蛋白的表達，并通過上調IL-12和IFN-γ來調節免疫應答，誘導肺癌細胞凋亡[13]。本研究探討了川貝母對卵清蛋白(ovalbumin，OVA)致敏支氣管哮喘小鼠的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 川貝母粉由成都市康華藥業股份有限公司提供。提取川貝母粉7.0 mg、14.0 mg和21.0 mg，分別溶于5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl，CMC) 5 ml中，現用現配。OVA(A5253，100 g)、氫氧化鋁凝膠(A8222，250 ml)(美國Sigma公司)；地塞米松磷酸鈉注射液(5 mg/支，焦作市國藥集團容生制藥有限公司)；總RNA抽提試劑(Trizol)、反轉錄試劑盒(大連TaKaRa公司)；總蛋白提取試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)；LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；兔抗JAK3、p-JAK3、STAT6、p-STAT6、IL-4抗體及山羊抗兔IgG抗體，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(美國Abcam公司)；酶聯免疫吸附(ELISA)測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)試劑盒(美國Kamiya公司)；增強型化學發光(ECL)試劑(美國Thermo公司)。超聲霧化器(魚躍402AI，重慶永健生物技術有限公司)；霧化箱(以有機玻璃為材料自制，規格：40 cm×30 cm×20 cm)；實時反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)儀(ABI 7300，美國ABI公司)；微量加樣器(3112，德國Eppendorf公司)；自動平衡離心機(LDZ5-2，北京京立離心機有限公司)；電子天平(UW820S，日本島津公司)；BH-2光學顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(Elx800，美國Bio-Tek公司)。

1.2 實驗動物 60只SPF級BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周齡，由河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院動物實驗中心提供(實驗動物生產合格證號：SCXK豫2019-022)。飼養溫度為25 ℃，濕度為20%～25%，自由進食和飲水。實驗過程符合國家和單位有關實驗動物管理和使用的規定。

1.3 小鼠哮喘模型制備及實驗分組 取50只小鼠，實驗第1、8天分別腹腔注射0.2 mg OVA和1 mg氫氧化鋁粉末制成的混懸液0.2 ml，即為首次致敏。實驗第15天，將小鼠分別置于超聲霧化器中，給予1%的OVA生理鹽水噴霧霧化吸入，每周3次，每次20 min，持續4周，直至實驗結束。小鼠出現腹肌痙攣、呼吸加快、站立不穩等癥狀表示激發成功。50只小鼠均激發成功。

將造模成功的50只小鼠隨機分為OVA模型組(灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉)、地塞米松組(腹腔注射0.5 mg/kg地塞米松)及川貝母低、中、高劑量組(灌胃7.0、14.0、21.0 mg/kg川貝母)，每組10只；余10只正常小鼠作為空白對照組(用等體積的生理鹽水代替OVA處理，灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉)。每天給藥1次，連續給藥4周。

1.4 小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎性細胞計數及BDNF含量測定 給藥結束后，各組小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，剪開皮膚，分離氣管并做一橫向切口，插入氣管插管。結扎右主支氣管，經氣管插管以10 ml生理鹽水灌洗左肺，收集BALF，經2000 r/min離心15 min，棄上清液。取沉渣用1 ml PBS重懸，吸取10 μl加至血細胞計數板，在高倍顯微鏡下計數炎性細胞總數。取100 μl細胞懸液涂布在載玻片上，用迪夫快速染色液(Diff-Quik)染色后，進行分類細胞(中性粒細胞、酸性粒細胞和淋巴細胞)計數。

采用BDNF試劑盒檢測BALF中BDNF的含量，操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5 氣道酚紅排泄量測定 末次給藥后0.5 h，各組小鼠腹腔注射0.5%苯酚紅溶液(20 ml/kg)，30 min后處死小鼠，剝離氣管并取一段等長氣管，放入含3 ml生理鹽水的EP管中，取上清液加入0.1 ml 5%NaHCO3，采用紫外分光光度計測定546 nm處的吸光度值。

1.6 ELISA法檢測血清中免疫球蛋白E(IgE)、IL-4、IL-13、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)濃度 給藥結束后，通過眼球采血采集各組小鼠血液1 ml，離心后取上清，測定血清中IgE、IL-4、IL-13、IFN-γ、TNF-α的濃度，操作步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.7 RT-q P CR 檢測肺組織中J A K 3、STAT 6、IL-4mRNA的表達 取各組小鼠肺組織，按試劑盒說明書步驟提取肺組織總RNA，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行實時定量PCR，反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列：JAK3正義鏈5'-ACACCTCTGATCCCTCAGC-3'，反義鏈5'-GCGAATGATAAACAGGCAGGATG-3'；STAT6正義鏈5'-CCTGGTCGGTTCAGATGCTTT-3'，反義鏈5'-GTGCGGCAAGATGCTGTTTC-3'；IL-4正義鏈5'-CCCCAGCTAGTTGTCATCCTG-3'，反義鏈5'-CAAGTGATTTTTGTCGCATCCG-3'；Sirt1正義鏈5'-TGGCAAAGGAGCAGATTAGTAGG-3'，反義鏈5'-CTGCCACAAGAACTAGAGGATAAGA-3'。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達水平。

1.8 Western blotting檢測肺組織中JAK3、STAT6、IL-4蛋白的表達 使用RIPA裂解液提取各組肺組織總蛋白，并溶解于SDS蛋白上樣緩沖液中。取40 μg上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉至PVDF膜上；用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h，加入抗JAK3抗體(ab45141；1:300)、抗p-JAK3抗體(ab278789；1:500)、抗STAT6抗體(ab32520；1:300)、抗p-STAT6抗體(ab188080；1:1000)、抗IL-4抗體(ab62351；1:500)4 ℃孵育過夜；TBST漂洗后，加入HRP標記的IgG抗體(ab205718；1:1000)室溫孵育1 h，ECL顯影液曝光、定影后晾干拍照，以GAPDH為內參，用ImageJ軟件進行蛋白定量分析。

1.9 統計學處理 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。實驗數據以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Duncan檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 川貝母對OVA小鼠氣道酚紅排泄量和BALF中BDNF含量的影響 與空白對照組比較，OVA模型組小鼠氣道酚紅排泄量明顯降低(P＜0.05)，BALF中BDNF含量明顯增加(P＜0.05)。與OVA模型組比較，川貝母低、中、高劑量組小鼠氣道酚紅排泄量明顯增加(P＜0.05)，BALF中BDNF含量明顯降低(P＜0.05)；與地塞米松組比較，川貝母高劑量組小鼠氣道酚紅排泄量及BALF中BDNF含量無明顯變化(P>0.05)；與川貝母低劑量組比較，川貝母高劑量組小鼠氣道酚紅排泄量明顯增加(P＜0.05)，BALF中BDNF含量明顯降低(P＜0.05) (表1)。

2.2 川貝母對OVA小鼠BALF中炎性細胞數量的影響 與空白對照組比較，OVA模型組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數量及炎性細胞總數明顯增多(P＜0.05)；與OVA模型組比較，川貝母低、中、高劑量組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數量及炎性細胞總數明顯減少(P＜0.05)；與地塞米松組比較，川貝母高劑量組小鼠BALF中炎性細胞數量無明顯變化(P>0.05)；與川貝母低劑量組比較，川貝母高劑量組小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數量及炎性細胞總數明顯減少(P＜0.05)(表1)。

表1 各組小鼠氣道酚紅排泄量、BALF中BDNF含量及炎性細胞數量比較(±s, n=10)Tab.1 Comparison of the Fritillaria cirrhosa on airway phenol red excretion, BDNF and inflammatory cells in BALF in mice among groups (±s, n=10)

表1 各組小鼠氣道酚紅排泄量、BALF中BDNF含量及炎性細胞數量比較(±s, n=10)Tab.1 Comparison of the Fritillaria cirrhosa on airway phenol red excretion, BDNF and inflammatory cells in BALF in mice among groups (±s, n=10)

BDNF. 腦源性神經營養因子；BALF. 支氣管肺泡灌洗液；OVA. 卵清蛋白；與空白對照組比較，(1)P＜0.05；與OVA模型組比較，(2)P＜0.05；與地塞米松組比較，(3)P＜0.05；與川貝母低劑量組比較，(4)P＜0.05

淋巴細胞數(×104/ml)空白對照組 2.01±0.01 1.02±0.01 57.00±1.16 1.02±0.58 3.50±0.21 4.52±0.21 OVA模型組 0.47±0.02(1) 2.74±0.03(1) 125.67±2.60(1) 66.12±1.55(1) 12.81±0.17(1) 15.47±0.20(1)地塞米松組 2.07±0.02(2) 1.21±0.04(2) 87.01±2.31(2) 35.18±1.16(2) 4.80±0.23(2) 8.47±0.18(2)川貝母低劑量組 1.53±0.03(1)(2)(3) 2.01±0.05(1)(2)(3) 109.33±3.48(1)(2)(3) 58.67±0.88(1)(2)(3) 10.37±0.23(1)(2)(3) 12.37±0.23(1)(2)(3)川貝母中劑量組 1.77±0.03(1)(2)(3) 1.79±0.03(1)(2)(3)(4) 97.33±1.76(1)(2)(3) 45.66±2.03(1)(2)(3)(4) 6.97±0.20(1)(2)(3)(4) 9.82±0.07(1)(2)(3)(4)川貝母高劑量組 2.06±0.02(2)(4) 1.30±0.04(2)(4) 86.03±2.11(1)(2)(4) 31.67±1.20(1)(2)(4) 5.53±0.15(2)(4) 8.36±0.05(1)(2)(4)組別 酚紅排泄量(mg/kg) BDNF(ng/ml) 炎性細胞總數(×104/ml)嗜酸性細胞數(×102/ml)中性粒細胞數(×104/ml)

2.3 川貝母對OVA小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α濃度的影響 ELISA檢測結果顯示，與空白對照組比較，OVA模型組小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α濃度明顯升高(P＜0.05)，而IFN-γ濃度及IFN-γ/IL-4比值(反映Th1/Th2平衡)明顯降低(P＜0.05)；與OVA模型組比較，川貝母低、中、高劑量組小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13和TNF-α濃度均明顯降低(P＜0.05)，而IFN-γ濃度和IFN-γ/IL-4比值明顯升高(P＜0.05)；與地塞米松組比較，川貝母高劑量組小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α、IFN-γ濃度及IFN-γ/IL-4比值無明顯變化(P>0.05)；與川貝母低劑量組比較，川貝母中、高劑量組小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13濃度明顯降低(P＜0.05)，而IFN-γ濃度及IFN-γ/IL-4比值明顯升高(P＜0.05)(表2)。

表2 各組小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α、INF-γ濃度比較(±s, n=10)Tab.2 Comparison of the serum levels of IgE, IL-4, IL-13, TNF-α and INF-γ of mice among groups (±s, n=10)

表2 各組小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α、INF-γ濃度比較(±s, n=10)Tab.2 Comparison of the serum levels of IgE, IL-4, IL-13, TNF-α and INF-γ of mice among groups (±s, n=10)

IgE. 免疫球蛋白E；IL-4. 白細胞介素-4；TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；IFN-γ. γ干擾素；OVA. 卵清蛋白；與空白對照組比較，(1)P＜0.05；與OVA模型組比較，(2)P＜0.05；與地塞米松組比較，(3)P＜0.05；與川貝母低劑量組比較，(4)P＜0.05

組別 IgE(ng/ml) IL-4(ng/ml) IL-13(ng/ml) TNF-α(pg/ml) IFN-γ(pg/ml) INF-γ/IL-4空白對照組 21.50±0.74 64.47±0.69 8.17±0.35 622.67±6.06 2032.67±16.70 31.54±0.41 OVA模型組 184.93±2.63(1) 115.80±1.91(1) 26.47±0.38(1) 724.18±8.39(1) 1614.33±12.73(1) 13.95±0.34(1)地塞米松組 41.80±1.03(2) 71.82±1.71(2) 14.13±0.66(2) 625.33±3.71(2) 2066.67±19.34(2) 24.30±0.65(2)川貝母低劑量組125.37±1.32(1)(2)(3) 96.23±1.07(1)(2)(3) 22.45±0.54(1)(2)(3) 688.15±2.08(1)(2)(3) 1803.12±24.30(1)(2)(3) 18.74±0.20(1)(2)(3)川貝母中劑量組83.82±1.67(1)(2)(3)(4)89.63±1.35(1)(2)(3)(4)18.13±0.27(1)(2)(3)(4) 668.33±4.63(1)(2)(3) 1885.33±21.49(1)(2)(3)(4)21.04±0.30(1)(2)(3)(4)川貝母高劑量組43.70±0.89(2)(4) 74.72±0.96(2)(4) 14.37±0.63(2)(4) 634.33±4.10(2)(4) 2055.00±12.70(2)(4) 24.27±0.41(2)(4)

2.4 川貝母對OVA小鼠肺組織中JAK3/STAT6信號通路相關mRNA和蛋白表達的影響 RT-qPCR檢測結果顯示，與空白對照組比較，OVA模型組小鼠肺組織中JAK3、STAT6、IL-4mRNA相對表達水平明顯升高(P＜0.05)；與OVA模型組比較，川貝母低、中、高劑量組小鼠肺組織中JAK3、STAT6、IL-4mRNA相對表達水平明顯降低(P＜0.05)；與地塞米松組比較，川貝母高劑量組小鼠肺組織中JAK3、STAT6、IL-4mRNA相對表達水平無明顯變化(P>0.05)；與川貝母低劑量組比較，川貝母中、高劑量組小鼠肺組織中JAK3、STAT6、IL-4mRNA相對表達水平明顯降低(P＜0.05)(圖1A)。

Western blotting檢測結果顯示，與空白對照組比較，OVA模型組小鼠肺組織中p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6、IL-4蛋白相對表達水平明顯升高(P＜0.05)；與OVA模型組比較，川貝母低、中、高劑量組小鼠肺組織中p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6、IL-4蛋白相對表達水平明顯降低(P＜0.05)；與地塞米松組比較，川貝母高劑量組小鼠肺組織中p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6、IL-4蛋白相對表達水平無明顯變化(P>0.05)；與川貝母低劑量組比較，川貝母中、高劑量組小鼠肺組織中p-JAK3/JAK3、p-STAT6/STAT6、IL-4蛋白相對表達水平明顯降低(P＜0.05)(圖1B)。

圖1 各組小鼠肺組織中JAK3/STAT6信號通路相關mRNA和蛋白相對表達水平比較(n=6)Fig.1 Comparison of the levels of the JAK3/STAT6 pathway related mRNA and protein in lung tissues of mice among groups (n=6)

3 討 論

哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，其被過敏原或其他環境因素激發后，大量肥大細胞、嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等炎性細胞被釋放，并伴隨大量的IL-4、IL-13等炎性因子釋放，從而打破Th1/Th2的平衡。研究發現，一些天然中草藥及其成分可通過調節Th1/Th2的平衡緩解哮喘病情，例如：馬齒莧提取物可增大哮喘模型大鼠BALF中INF-γ/IL-4的比值，改善Th1/Th2平衡和哮喘大鼠的氣道反應性[5]；人參皂苷Rh1可通過調節Th1/Th2細胞因子的平衡而緩解OVA誘導的哮喘小鼠的氣道重塑和炎癥[10]。值得注意的是，有研究發現川貝母止嗽顆粒對哮喘豚鼠模型具有較好的平喘作用[14]。此外，川貝母可明顯減輕哮喘模型小鼠的氣道炎癥，其作用機制可能與抑制細胞外信號調節激酶(ERK/MAPK)通路的激活有關[12]。本研究發現，川貝母給藥可增加小鼠氣道酚紅排泄量，對OVA致敏小鼠具有祛痰效果。不同劑量的川貝母均可降低OVA誘導的哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數量及炎性細胞總數，表明川貝母可減輕OVA致敏小鼠支氣管哮喘誘發的炎癥。此外，川貝母給藥明顯降低了OVA小鼠血清中IgE、IL-4、IL-13、TNF-α的濃度，并升高了IFN-γ的濃度和IFN-γ/IL-4比值，表明川貝母可改善OVA致敏支氣管哮喘造成的小鼠免疫系統Th1/Th2失衡。

既往研究發現，由過敏原引起的哮喘患者BALF中BDNF水平明顯升高[15-17]，表明BDNF參與了哮喘的發病機制。Watanabe等[18]發現，哮喘的嚴重程度與BDNF升高程度相關。此外，研究發現，BDNF可促進氣道平滑肌細胞的增殖、遷移和細胞外基質沉積，誘導哮喘患者的氣道纖維化、氣道高反應性和氣道重塑[19]。鑒于BDNF在氣道中的多效性，其可能是新穎且有吸引力的治療靶標。本研究發現，與空白對照組比較，OVA模型組小鼠BALF中BDNF含量明顯增加，而川貝母給藥明顯降低了小鼠BALF中BDNF的含量。還有研究發現，調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)/Th17細胞失衡在哮喘的發病機制中起著重要作用[20]。Th17細胞可募集中性粒細胞，間接吸引嗜酸性粒細胞，加劇哮喘發作。本研究發現，川貝母可降低OVA致敏小鼠BALF中嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的數量，提示川貝母可能調節哮喘中Treg/Th17細胞的平衡。但川貝母改善小鼠哮喘的作用機制尚不明確，后續須進一步深入研究川貝母對OVA致敏小鼠肺組織中Treg/Th17平衡的影響及機制。

JAK/STAT信號通路由酪氨酸激酶JAK家族和轉錄因子STAT家族組成，是一種重要的細胞因子信號轉導通路[21]。JAK-STAT級聯觸發過敏性哮喘中細胞因子介導的信號轉導[8]。研究發現，Th2細胞合成的炎性介質尤其是IL-13是JAK/STAT6通路的上游刺激因子，可誘導STAT6磷酸化，STAT6磷酸化參與杯狀細胞化生，從而導致黏液分泌過多[8-9]。此外，STAT6是產生Th2相關細胞因子IL-4、IL-5和IL-13的關鍵轉錄因子[9,22]。因此，在哮喘進程中，JAK/STAT6通路與Th1/Th2平衡相關，在誘導氣道高反應性和黏液過度分泌中發揮重要作用。值得注意的是，有研究發現，川貝母水提物可上調STAT1和STAT4蛋白的表達，并促進STAT1和STAT4的靶蛋白IL-12與IFN-γ的分泌，從而調節免疫應答，誘導肺癌細胞凋亡[13]。由此推測，川貝母可能通過調節JAK/STAT通路和Th1/Th2平衡而在哮喘中發揮作用。本研究結果顯示，川貝母可抑制JAK3/STAT6信號通路的激活，降低JAK3、STAT6、IL-4mRNA水平，以及p-JAK3、p-STAT6、IL-4蛋白水平，從而緩解OVA致敏小鼠的哮喘癥狀，這為川貝母治療支氣管哮喘提供了理論支持。

綜上所述，本研究結果表明，川貝母能夠減輕OVA致敏哮喘小鼠的炎癥和Th1/Th2失衡，其作用機制可能與抑制JAK3/STAT6信號通路的激活有關，其具體機制有待后續進一步研究探索。