新疆孜然不同種類提取物的體外抗氧化 活性分析

◎ 高 萌，張世鈺，任曉鏷

（1.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學 食品科學與工程學院，新疆 阿拉爾 843300）

孜然（Cuminum cyminumL.），又名孜然芹、安息茴香等，屬傘形目，具有強烈特有的辛香。孜然目前在我國種植地區主要分布在新疆、內蒙古、甘肅等地，新疆目前播種面積已近200 km2，主要分布在吐魯番、庫車、沙雅等地區。孜然不僅是傳統香辛料，還因其活性成分豐富，所以具有抗氧化、抗菌等功效，在傳統醫學中被用于治療低血脂癥和糖尿病等[1-3]。然而，目前孜然的利用仍以粗加工制品為主，未能充分利用其豐富的活性成分，造成較大浪費。國內外多位學者已經對部分地區的孜然中有效成分的提取方法、活性成分分析鑒定及其抗氧化活性等開展了相關研究，但是截至目前，對于新疆產孜然的相關研究較少，也未對孜然不同種類提取物的抗氧化活性進行對比分析。本研究以新疆產孜然為研究對象，借助超聲波輔助提取技術和超臨界CO2提取技術分別制備孜然水提物、醇提物和精油，對不同種類提取物中的總多酚、總黃酮的含量進行定量分析，對比分析不同種類提取物的自由基清除活性和對金屬離子的還原能力，明確不同提取物的抗氧化活性，從而進一步開發孜然深加工產品，提高孜然附加值，為新疆優質孜然資源走向國內外市場提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孜然果實，購于新疆阿拉爾市市場（新疆產孜然）；福林酚，北京索萊寶科技有限公司；1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH），美國Sigma 公司；2,2’-聯氮雙 （3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），上海源葉生物科技有限公司；其他試驗相關試劑均為國產分析純。

CTXG-10B 超聲循環提取機，北京弘祥隆生物技術開發公司；Lab-1C-80 真空冷凍干燥機，上海坤誠科學儀器有限公司；RE-3000 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器有限公司；Spe-ed SFE-2 型超臨界萃取裝置，美國ASI 公司；Synergy H1 多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司北京代表；UV-2450 紫外分光光度計，日本島津公司；LE203E 電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；EMS-20水浴鍋，常州諾基儀器有限公司；TGL-20B 高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 孜然不同種類提取物的制備

孜然水提物、醇提物的制備參考薛文君等[4]的方法并修改；孜然精油的制備參照沙拉買提·托乎提等[5]萃取孜然精油的最佳工藝條件并修改。

1.2.2 孜然不同種類提取物中總多酚、總黃酮含量的測定

總多酚含量的測定采用Folin-Ciocateu 比色法[6]；總黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法[7]。

1.2.3 孜然不同種類提取物體外抗氧化活性測定

本研究以DPPH 自由基清除能力、ABTS 自由基清除能力、羥自由基清除能力和還原能力這4 項指標對孜然不同種類提取物的體外抗氧化活性進行分析。不 同提 取物 濃 度設 置 為0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、 1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1、 8.0 mg·mL-1以及10.0 mg·mL-1，以抗壞血酸作為對照進行試驗，每次試驗重復3 次。

孜然不同提取物對DPPH 自由基清除能力的測定參照CHEN 等[8]方法，對ABTS 自由基清除能力的測定參照LIANG 等[9]的方法并修改，對羥自由基清除能力的測定參照趙園園[10]的方法并修改，還原力的測定參照YE 等[11]的方法并修改。

1.3 數據處理

所有實驗數據平行測定3 次，結果表示為平均值± 標準差，采用SPSS 26.0 軟件對實驗數據進行相關性分析、方差分析，顯著水平為P＜0.05；用OriginPro 2021 繪圖。

2 結果與分析

2.1 孜然不同種類提取物中總多酚、總黃酮含量

孜然不同提取物中活性成分含量如表1 所示，孜然醇提物的總多酚、總黃酮含量顯著高于孜然水提物（P＜0.05），其中孜然醇提物的總多酚含量為 20.29 mg·g-1，總黃酮含量為2.94 mg·g-1。本研究中醇提物的總多酚含量與孫云鵬等[12]研究盛花期的新疆孜然總多酚含量20.56 mg·g-1基本一致；高于SHAN等[13]研究發現土耳其的孜然甲醇提取物中總多酚含量 2.3 mg·g-1；而REBEY 等[14]研究發現突尼斯孜然花、根提取物的總黃酮含量分別為5.6 mg·g-1和0.4 mg·g-1。以上所測得總多酚、總黃酮含量的不同可能歸因于研究中所使用孜然的部位、生長條件、提取溶劑和方法等有所差異。

表1 孜然不同種類提取物中總多酚、總黃酮含量表

2.2 孜然不同種類提取物清除DPPH 自由基的能力

DPPH 自由基清除能力被廣泛用于表征天然植物提取物的體外抗氧化活性[15]。由圖1 可以看出，隨著3種孜然提取物濃度的增加，其對DPPH 自由基的清除能力逐漸增強。當提取物的濃度低于2 mg·mL-1時，孜然水提物的清除活性相對較強，顯著高于醇提物和孜然精油（P＜0.05）；而當提取物濃度高于4 mg·mL-1時，孜然醇提物對DPPH 自由基的清除活性則顯著高于水提物和孜然精油（P＜0.05）。濃度為2 mg·mL-1的醇提物清除率與趙旭等[16]研究發現新疆產孜然醇提物對DPPH 自由基清除率（46.53%）相近，但均低于該濃度條件下孜然水提物的清除率，這可能是由于不同種類提取物中成分差異所致。在濃度低于2 mg·mL-1時水提物抗氧化活性強于醇提物的原因可能是水提物中的某些活性化合物在較低濃度時對DPPH 自由基的清除活性較強所致，隨著濃度增加，醇提物由于其總多酚、總黃酮含量高于水提物，較高含量的有效活性成分使其對DPPH 自由基的清除能力更強。

圖1 孜然不同種類提取物對DPPH 自由基的清除能力圖

在濃度為10 mg·mL-1時，孜然水提物、醇提物和精油對DPPH 自由基的清除率分別為（82.59±1.10）%、（94.40±0.62）%和（75.27±1.26）%，孜然水提物、醇提物、精油對DPPH 自由基清除活性的IC50值分別 為0.48 mg·mL-1、1.78 mg·mL-1，4.38 mg·mL-1，這與王強等[17]研究得出的新疆孜然醇提物的IC50值為 1.07 mg·mL-1和HOSSEINI[18]研究發現伊朗不同地區的孜然油對DPPH 自由基清除率為96.24%的結果一致，但卻遠低于CHEN[19]研究的孜然精油的IC50值 35.94 mg·mL-1。這可能是由于孜然種植環境條件等原因導致不同孜然提取物中抗氧化活性成分存在較大差異所致。

2.3 孜然不同種類提取物清除ABTS 自由基的能力

從圖2 可知，3種孜然提取物對ABTS 自由基均具有清除效果，隨著濃度的增加，其對ABTS 自由基的清除能力逐漸增強。在所選濃度范圍內，醇提物對ABTS 自由基的清除能力顯著高于水提物和精油（P＜0.05），由于DPPH 和ABTS 的自由基清除試驗反應原理和條件不同，醇提物對于兩種自由基的清除活性不一致。在濃度為10 mg·mL-1時，醇提物對ABTS 自由基的清除率高達（92.52±1.94）%，而水提物和精油對ABTS 自由基的清除率則分別為（85.34%±0.89）%和（73.59±1.07）%；孜然醇提物、水提物、精油對ABTS 自由基清除活性的IC50值分別為0.24 mg·mL-1、0.48 mg·mL-1和2.75 mg·mL-1，這與MAHNASHI 等[20]研究發現孜然精油對ABTS 自由基的IC50值為2.71 mg·mL-1的結果基本一致。研究報道 稱，植物提取物具有較強的ABTS 自由基清除能力可能與其富含的酚類化合物有關，包括類黃酮和酚酸等[21]。這與本研究中孜然醇提物的總多酚、總黃酮含量高于水提物，故醇提物對ABTS 自由基清除效果較強的結論一致。不同提取物的ABTS 自由基清除活性的差異可能是由于不同種類提取物活性成分不同導致的。

2.4 孜然不同種類提取物清除羥自由基的能力

由圖3 可以看出，在所選濃度范圍內，醇提物的清除活性顯著高于水提物和精油（P＜0.05），在濃度為6 mg·mL-1時，本研究的醇提物對羥自由基清除效果高于古力伯斯坦·艾達爾等[22]研究的孜然醇提液。濃度為10 mg·mL-1時，水提物、醇提物和精油的清除率對羥自由基的清除率為（82.59±1.10）%、（87.53±1.26）%和（75.27±1.26）%；孜然水提物、醇提物和孜然精油對羥自由基清除活性的IC50值分別為1.03 mg·mL-1、0.38 mg·mL-1和1.63 mg·mL-1，其中孜然精油對羥自由基的清除能力較差。THIPPESWAMY 等[23]研究發現孜然能夠清除羥基自由基，是一種有效的天然抗氧化劑，并且指出其高抗氧化活性可能與其總酚含量較高有關。本實驗結果與HUSAIN 等[24]的研究結果一致，他們發現C-4 位羰基官能團的存在對羥基自由基的猝滅能力起重要作用，這可能是由于孜然中具有羰基的槲皮素等化合物，對羥基的猝滅能力強，孜然醇提物中總黃酮含量高于水提物，所以孜然醇提物呈現對羥自由基較優的清除效果。

圖3 孜然不同種類提取物對羥自由基的清除能力圖

2.5 孜然不同種類提取物的還原力

一般認為物質的還原性與其抗氧化性之間呈正相關，還原力與抗氧化劑的能力成一定比例，吸光度值越大，說明抗氧化劑的還原力越強[25]。從圖4 中可以看出，3種孜然提取物均對Fe3+有一定的還原能力，不同種類提取物的還原力有一定差異。當提取物濃度低于6 mg·mL-1時，孜然醇提物的還原力顯著更高 （P＜0.05），其次為孜然水提物；而當濃度高于 6 mg·mL-1時，孜然水提物的還原力顯著高于孜然醇提物和孜然精油（P＜0.05）。當濃度為10 mg·mL-1時，孜然水提物、醇提物和精油的還原力為1.32±0.02、1.08±0.01 和1.05±0.01，其中孜然精油的還原力最低。本研究中醇提物的還原力與張婷等[26]研究孜然不同部位的醇提物還原力一致。在濃度高于6 mg·mL-1時，水提物的還原力更強，這可能是水提物中的某些活性化合物（如多酚、黃酮類物質）對金屬離子具有更強的螯合能力所致。另外，不同提取物的還原力的差異可能是由于提取溶劑不同，其所含抗氧化物質的數量和種類也不同，各物質的協同作用也不一致[27]。

圖4 孜然不同種類提取物的還原力圖

本研究結果表明不同種類的孜然提取物具有很強的抗氧化活性，這可能與其富含不同種類的活性物質密切相關[28]。有研究表明孜然中的主要活性成分是多酚類、膽堿類等化合物，這其中多酚類化合物通常具有較強的抗氧化活性[29]。ANI 等[30]研究發現孜然中的酚酸和黃酮類物質主要是沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸、鞣花酸、阿魏酸和槲皮素等；吳素玲等[31]對 8 個產地的孜然活性成分及其含量進行了分析，從孜然中分離得到的芹菜素、槲皮素、木犀草素等黃酮及其苷類化合物。孜然中精油占2%～4%，但由于孜然生長環境及精油提取的差異，孜然精油的化學成分分析結果也有所不同，但主要為單萜、倍半萜、芳香族醛、酮和醚類物質，這些萜類、芳香族醛及酮醚類化合物對孜然風味的形成具有重要作用[32-33]。

本研究中孜然醇提物和孜然水提物具有良好的抗氧化活性，可能是由于這2種提取物中總多酚、總黃酮含量較高，其多酚類化合物與不同種類的自由基和氧化劑之間有較高的反應活性，能夠在一定程度上清除自由基和還原金屬離子[34]。二者的差異，尤其是醇提物表現出對自由基較強的清除活性，則可能是由于采用有機溶劑乙醇提取的多酚類活性成分較多所致，這與本研究中總多酚、總黃酮測定結果一致。而在孜然精油中則可能包括更多非多酚類的萜類化合物，其更容易發生自氧化反應形成不飽和脂質，表現出的抗氧化活性一般較弱，這可能是本研究中孜然精油的抗氧化活性弱于孜然醇提物和水提物的主要原因[35]。

3 結論

本研究通過對孜然不同種類提取物中的總多酚、總黃酮的定量分析，對比分析了孜然水提物、孜然醇提物和孜然精油對DPPH 自由基、ABTS 自由基和羥自由基的清除能力及還原力。結果表明，3種孜然提取物均具有一定的體外抗氧化活性，但存在不同；在較高濃度條件下（≥4 mg·mL-1），孜然醇提物表現出相對最強的DPPH 自由基清除活性；在所選濃度范圍內，孜然醇提物對ABTS 自由基和羥自由基的清除活性相對最強，其次為孜然水提物，孜然精油相對最弱；在濃度高于6 mg·mL-1時，孜然水提物的還原力相對最強；醇提物中的總多酚和總黃酮含量高于水提物，所以總體而言醇提物的抗氧化活性強于水提物。綜合以上結果，可以根據不同的生產需求選擇不同種類的孜然提取物，在以追求較高抗氧化活性為目標時可選擇孜然醇提物，在以綠色、環保為目的時可選擇孜然水提物，在重視孜然風味時可選擇孜然精油。