發(fā)酵對(duì)啤特果汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

◎ 王炳文，楊延花，焦 斐，高 娟，周啟萍，楊 超，楊富民

（1.甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.金昌市食品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 金昌 737100）

啤特果又名酸巴梨，是薔薇科蘋果亞科梨屬，主產(chǎn)區(qū)為甘肅省臨夏海拔約2 400 m 的太子山麓。其性溫且味酸甜，風(fēng)味獨(dú)特[1]，富含多種蛋白質(zhì)、還原糖、粗纖維、維生素C、鞣酸、維生素B1、維生素B2以及鉀、鈣、鐵等多種微量元素，具有養(yǎng)胃潤肺、軟化血管、解酒保肝和消瀉止咳等功效[2]。啤特果屬秋子梨系，熟化后方可食用，但不易保存。目前除原果（鮮果、冷凍果）銷售外主要用于榨汁生產(chǎn)飲品[3]。

有關(guān)啤特果加工的研究主要集中在總黃酮和多糖提取、營養(yǎng)成分、飲料生產(chǎn)等方面[4]。如王永剛等[5]對(duì)啤特果的營養(yǎng)成分進(jìn)行了研究，楊旭星等[6]、齊勇等[7]研究了啤特果汁飲料的生產(chǎn)配方及工藝。揮發(fā)性物質(zhì)作為果汁中主要的風(fēng)味物質(zhì)，直接影響果汁的感官質(zhì)量，其種類及含量對(duì)改善果汁風(fēng)味和口感有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)發(fā)酵后的果汁不僅可以增加其營養(yǎng)物質(zhì)的含量，還可以降低自身含糖量，提高營養(yǎng)價(jià)值[8-9]。王麗萍等[10]發(fā)現(xiàn)枸杞飲料乳酸發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量和種類均有所增加。為了降低含糖量，開發(fā)啤特果發(fā)酵汁飲品，本研究對(duì)啤特果汁不同發(fā)酵階段風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行了對(duì)比分析，旨在為其進(jìn)一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤特果汁，購自甘肅和政縣八八啤特果集團(tuán)有限責(zé)任公司，可溶性固形物含量為8°Brix；2-辛醇（色譜級(jí)），美國Sigma 公司；氯化鈉（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；安琪耐高糖酵母菌，安琪酵母股份有限公司；科漢森釀酒酵母菌，科漢森（天津）食品添加劑有限公司；干酪乳桿菌，中國微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE1310-ISQ 氣相色譜- 質(zhì)譜儀(SIGMAALDRICH 上海貿(mào)易有限公司）；DB-WAX 氣相色譜柱（美國Agilent Technologies 公司）；PAL3 自動(dòng)三合一進(jìn)樣器系統(tǒng)（美國Agilent Technologies 公司）；HH-11-1 電熱恒溫水浴鍋（上海助藍(lán)儀器科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 啤特果發(fā)酵汁制備

將接入啤特果原汁1.5%的安琪耐高糖酵母與科漢森釀酒酵母復(fù)配菌（V∶V=1 ∶1）置于28 ℃發(fā)酵40 h，升溫至37 ℃，再接入5%干酪乳桿菌發(fā)酵16 h，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測

以未發(fā)酵啤特果原汁為對(duì)照，將發(fā)酵分為酵母發(fā)酵階段（安琪耐高糖酵母與科漢森釀酒酵母復(fù)配菌發(fā)酵）、乳酸菌發(fā)酵階段（復(fù)配乳酸菌發(fā)酵后接入干酪乳桿菌繼續(xù)發(fā)酵），分別測定所含的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分和含量。

1.3.3 風(fēng)味物質(zhì)萃取條件

參考王建剛等[11]的方法稍作修改。移取5.00 mL待測啤特果原汁和發(fā)酵汁樣液于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，分別加入1.50 g 氯化鈉、10 μL 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)2-辛醇 （10 mg·L-1)，30 ℃水浴鍋加熱30 min 后，萃取30 min，250 ℃解吸10 min。

1.3.4 儀器條件

（1）色譜條件。毛細(xì)管色譜柱VF-WAXms (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持3 min，以4 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1升溫至230 ℃，保持6 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，流速1 mL·min-1[12]。

（2）質(zhì)譜條件。EI 離子源70 eV、溫度230 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質(zhì)量范圍（m/z）：33 ～600。

1.3.5 定性定量分析

定性方法采用NIST 譜庫和人工對(duì)物質(zhì)進(jìn)行鑒定和譜圖解析。定量方法以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（質(zhì)量濃度19.96 μg·L-1），計(jì)算揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量。

式中：C1為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)各組分的含量，μg·L-1；A為各組分的峰面積；A0為內(nèi)標(biāo)的峰面積；C2為內(nèi)標(biāo)濃度，μg·L-1。

1.3.6 主成分分析

參考吳夢等[13]、韓之皓等[14]、移蘭麗等[15]對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析的方法，對(duì)啤特果原汁、酵母菌發(fā)酵階段及乳酸菌發(fā)酵階段檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Origin和SPSS 24進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原汁及發(fā)酵階段揮發(fā)性成分及含量

總離子流色譜圖見圖1 ～圖3。啤特果原汁及不同發(fā)酵階段啤特果汁在同一保留時(shí)間段的峰高不同，表明同一種揮發(fā)性物質(zhì)在不同發(fā)酵階段的含量不同。

圖1 啤特果原汁揮發(fā)性成分GC-MS 總離子流色譜圖

圖3 啤特果汁乳酸菌發(fā)酵階段揮發(fā)性成分GC-MS 總離子流色譜圖

圖2 啤特果汁酵母菌發(fā)酵階段揮發(fā)性成分GC-MS 總離子流色譜圖

不同發(fā)酵階段啤特果汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量變化如表1、圖4 所示。啤特果原汁檢出揮發(fā)性物質(zhì)共37種。其中酯類10種、醇類9種、酸類8種、酮類4種、醛類3種以及其他類3種，酯類、醇類和酸類為主要揮發(fā)性成分。酵母菌發(fā)酵階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共有49種，其中酯類物質(zhì)有16種、醇類11種、酸類7種、酮類7種、醛類4種以及其他類4種。乳酸菌發(fā)酵階段揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)共有52種，其中酯類物質(zhì)有16種、醇類物質(zhì)12種、酸類物質(zhì)8種、酮類物質(zhì)7種、醛類物質(zhì)5種以及其他類4種。發(fā)酵使其種類增加了40種，其中酯類增加明顯；酸類在酵母菌發(fā)酵階段略有減少，接入乳酸菌后又有所上升；酮類、醇類和醛類則呈增加趨勢，其中醇類和醛類增加幅度較小，其他類數(shù)量基本保持不變。在含量方面，啤特果原汁揮發(fā)性物質(zhì)總含量為47.57 μg·L-1，酵母菌發(fā)酵階段總含量為1 046.43 μg·L-1，再接入乳酸菌發(fā)酵后其總含量為1 269.06 μg·L-1。其中以3-己烯酸乙酯、山梨酸乙酯、3,4-二甲基-1,2-環(huán)戊二酮、苯甲醛、3,4,5-三甲基-4-庚醇、苯乙醇以及正戊醇增加較為明顯。由此可見，發(fā)酵使得大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量有所增加。

圖4 發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)種類變化圖

表1 啤特果原汁及不同發(fā)酵階段揮發(fā)性物質(zhì)含量的GC-MS 分析結(jié)果表（單位：μg·L-1）

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 主成分分析

原汁、酵母發(fā)酵汁、酵母+乳酸菌發(fā)酵汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分對(duì)比分析見圖5。提取2 個(gè)主成分（主成分1：65.213%；主成分2：34.787%）可反映關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)變化及樣品分布情況[16]。啤特果原汁主要分布在兩個(gè)主成分的負(fù)半軸，酵母菌發(fā)酵汁主要分布在主成分1 的正半軸，酵母菌+乳酸菌發(fā)酵汁主要分布在主成分2 的正半軸，大部分揮發(fā)性物質(zhì)都分布在PC1 和PC2 的正向區(qū)間。其中原汁中主要反映甲酸辛酯、棕櫚酸異丙酯等風(fēng)味物質(zhì)特征，酵母菌發(fā)酵階段主要反映辛酸乙酯、3-羥基己酸乙酯、棕櫚酸乙酯和 3-羥基丁酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)特征，其中2-十六醇、正丁醇、七聚乙二醇等醇類化合物貢獻(xiàn)較大，乳酸菌發(fā)酵階段主要反映甲酸松油酯、3,4,4-三甲基-3-戊醇、3,4,5-三甲基-4-庚醇和庚酸等風(fēng)味物質(zhì)特征，其中甲酸松油酯、山梨酸乙烯酯、大馬士酮等化合物貢獻(xiàn)較大。不同菌種發(fā)酵所測的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)各有特點(diǎn)，使啤特果汁的風(fēng)味有了很大的提高。

圖5 發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析因子載荷圖

3 討論

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量是反映果汁口感的重要指標(biāo)，微生物代謝產(chǎn)生不同種類的物質(zhì)，是改變揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量的有效手段。目前，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取方法有熱脫附[17]、溶劑萃取法[18]、超臨界流體萃取法和水蒸氣蒸餾法[19]以及超臨界流體萃取法[20]等，這些方法對(duì)于樣本測定是有效的，但也存在操作復(fù)雜、分析成本高等不足，HS-SPME 是一種新型樣本制備技術(shù)，適合復(fù)雜樣本的快速分析[21]。為了掌握啤特果汁經(jīng)不同菌種發(fā)酵對(duì)其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用HS-SPME 和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)啤特果汁發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行檢測和分析，簡化樣本處理過程，縮短分析時(shí)間，為果汁飲料的開發(fā)和品質(zhì)控制提供高效檢測手段和 技術(shù)。

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，啤特果的原汁中共有37種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這與魏晉梅等[22]測定的啤特果果實(shí)中含有的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果接近。當(dāng)啤特果繼續(xù)發(fā)酵，果汁中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量明顯增加，這與劉佳奇等[9]、王麗萍等[10]研究果汁飲料發(fā)酵前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果相似。這可能是因?yàn)楣?jīng)過發(fā)酵生成醇類物質(zhì)，乳酸菌發(fā)酵生成酸類物質(zhì)，并通過酯化反應(yīng)生成種類豐富的酯類物質(zhì)。本試驗(yàn)中發(fā)酵后揮發(fā)性物質(zhì)酯類、醇類和酮類含量增加明顯，醛類變化較小，酸類和其他類含量基本無變化。其中酯類揮發(fā)性物質(zhì)賦予啤特果汁濃郁的果香、花香和甜香，如甲酸松油酯、乙酸松油酯賦予果汁清甜香氣，有檸檬和柑橘香型香氣。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，啤特果發(fā)酵后醇類和酮類物質(zhì)明顯增加，醇類是酵母菌發(fā)酵的主要代謝產(chǎn)物，其主要呈現(xiàn)出清新的花草香氣，如苯乙醇賦予果汁清甜的玫瑰花香，酮類物質(zhì)中以3,4-二甲基-1,2-環(huán)戊二酮含量增加較為明顯。這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的協(xié)同作用使啤特果汁發(fā)酵香渾然一體，賦予了啤特果發(fā)酵汁飲料獨(dú)特的風(fēng)味。

4 結(jié)論

本研究采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對(duì)啤特果果汁發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律進(jìn)行了分析。啤特果果汁經(jīng)酵母菌發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類增加了12種，經(jīng)乳酸發(fā)酵后增加了15種。發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)以酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)居多。主成分分析表明，發(fā)酵處理對(duì)啤特果汁的揮發(fā)性成分存在一定的影響，且不同菌種發(fā)酵處理對(duì)啤特果發(fā)酵汁的揮發(fā)性成分所起的作用不同，為啤特果汁新產(chǎn)品的開發(fā)提供了依據(jù)。