發酵對啤特果汁揮發性風味物質的影響

◎ 王炳文，楊延花，焦 斐，高 娟，周啟萍，楊 超，楊富民

（1.甘肅農業職業技術學院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；3.金昌市食品檢驗檢測中心，甘肅 金昌 737100）

啤特果又名酸巴梨，是薔薇科蘋果亞科梨屬，主產區為甘肅省臨夏海拔約2 400 m 的太子山麓。其性溫且味酸甜，風味獨特[1]，富含多種蛋白質、還原糖、粗纖維、維生素C、鞣酸、維生素B1、維生素B2以及鉀、鈣、鐵等多種微量元素，具有養胃潤肺、軟化血管、解酒保肝和消瀉止咳等功效[2]。啤特果屬秋子梨系，熟化后方可食用，但不易保存。目前除原果（鮮果、冷凍果）銷售外主要用于榨汁生產飲品[3]。

有關啤特果加工的研究主要集中在總黃酮和多糖提取、營養成分、飲料生產等方面[4]。如王永剛等[5]對啤特果的營養成分進行了研究，楊旭星等[6]、齊勇等[7]研究了啤特果汁飲料的生產配方及工藝。揮發性物質作為果汁中主要的風味物質，直接影響果汁的感官質量，其種類及含量對改善果汁風味和口感有著重要的作用。研究發現經發酵后的果汁不僅可以增加其營養物質的含量，還可以降低自身含糖量，提高營養價值[8-9]。王麗萍等[10]發現枸杞飲料乳酸發酵后揮發性風味物質含量和種類均有所增加。為了降低含糖量，開發啤特果發酵汁飲品，本研究對啤特果汁不同發酵階段風味物質的變化進行了對比分析，旨在為其進一步利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤特果汁，購自甘肅和政縣八八啤特果集團有限責任公司，可溶性固形物含量為8°Brix；2-辛醇（色譜級），美國Sigma 公司；氯化鈉（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；安琪耐高糖酵母菌，安琪酵母股份有限公司；科漢森釀酒酵母菌，科漢森（天津）食品添加劑有限公司；干酪乳桿菌，中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心。

1.2 儀器與設備

TRACE1310-ISQ 氣相色譜- 質譜儀(SIGMAALDRICH 上海貿易有限公司）；DB-WAX 氣相色譜柱（美國Agilent Technologies 公司）；PAL3 自動三合一進樣器系統（美國Agilent Technologies 公司）；HH-11-1 電熱恒溫水浴鍋（上海助藍儀器科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 啤特果發酵汁制備

將接入啤特果原汁1.5%的安琪耐高糖酵母與科漢森釀酒酵母復配菌（V∶V=1 ∶1）置于28 ℃發酵40 h，升溫至37 ℃，再接入5%干酪乳桿菌發酵16 h，4 ℃冷藏備用。

1.3.2 揮發性風味物質檢測

以未發酵啤特果原汁為對照，將發酵分為酵母發酵階段（安琪耐高糖酵母與科漢森釀酒酵母復配菌發酵）、乳酸菌發酵階段（復配乳酸菌發酵后接入干酪乳桿菌繼續發酵），分別測定所含的揮發性風味物質成分和含量。

1.3.3 風味物質萃取條件

參考王建剛等[11]的方法稍作修改。移取5.00 mL待測啤特果原汁和發酵汁樣液于20 mL 頂空進樣瓶中，分別加入1.50 g 氯化鈉、10 μL 內標物質2-辛醇 （10 mg·L-1)，30 ℃水浴鍋加熱30 min 后，萃取30 min，250 ℃解吸10 min。

1.3.4 儀器條件

（1）色譜條件。毛細管色譜柱VF-WAXms (30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持3 min，以4 ℃·min-1升溫至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃·min-1升溫至230 ℃，保持6 min；進樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，流速1 mL·min-1[12]。

（2）質譜條件。EI 離子源70 eV、溫度230 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描質量范圍（m/z）：33 ～600。

1.3.5 定性定量分析

定性方法采用NIST 譜庫和人工對物質進行鑒定和譜圖解析。定量方法以2-辛醇為內標物質（質量濃度19.96 μg·L-1），計算揮發性風味物質的含量。

式中：C1為揮發性風味物質各組分的含量，μg·L-1；A為各組分的峰面積；A0為內標的峰面積；C2為內標濃度，μg·L-1。

1.3.6 主成分分析

參考吳夢等[13]、韓之皓等[14]、移蘭麗等[15]對揮發性物質主成分分析的方法，對啤特果原汁、酵母菌發酵階段及乳酸菌發酵階段檢測出的揮發性風味物質進行主成分分析。

1.3.7 數據處理

采用Excel、Origin和SPSS 24進行數據分析，繪圖。

2 結果與分析

2.1 原汁及發酵階段揮發性成分及含量

總離子流色譜圖見圖1 ～圖3。啤特果原汁及不同發酵階段啤特果汁在同一保留時間段的峰高不同，表明同一種揮發性物質在不同發酵階段的含量不同。

圖1 啤特果原汁揮發性成分GC-MS 總離子流色譜圖

圖3 啤特果汁乳酸菌發酵階段揮發性成分GC-MS 總離子流色譜圖

圖2 啤特果汁酵母菌發酵階段揮發性成分GC-MS 總離子流色譜圖

不同發酵階段啤特果汁揮發性風味物質種類及含量變化如表1、圖4 所示。啤特果原汁檢出揮發性物質共37種。其中酯類10種、醇類9種、酸類8種、酮類4種、醛類3種以及其他類3種，酯類、醇類和酸類為主要揮發性成分。酵母菌發酵階段揮發性風味物質共有49種，其中酯類物質有16種、醇類11種、酸類7種、酮類7種、醛類4種以及其他類4種。乳酸菌發酵階段揮發性風味物質共有52種，其中酯類物質有16種、醇類物質12種、酸類物質8種、酮類物質7種、醛類物質5種以及其他類4種。發酵使其種類增加了40種，其中酯類增加明顯；酸類在酵母菌發酵階段略有減少，接入乳酸菌后又有所上升；酮類、醇類和醛類則呈增加趨勢，其中醇類和醛類增加幅度較小，其他類數量基本保持不變。在含量方面，啤特果原汁揮發性物質總含量為47.57 μg·L-1，酵母菌發酵階段總含量為1 046.43 μg·L-1，再接入乳酸菌發酵后其總含量為1 269.06 μg·L-1。其中以3-己烯酸乙酯、山梨酸乙酯、3,4-二甲基-1,2-環戊二酮、苯甲醛、3,4,5-三甲基-4-庚醇、苯乙醇以及正戊醇增加較為明顯。由此可見，發酵使得大部分揮發性風味物質總含量有所增加。

圖4 發酵前后揮發性物質種類變化圖

表1 啤特果原汁及不同發酵階段揮發性物質含量的GC-MS 分析結果表（單位：μg·L-1）

續表1

續表1

2.2 主成分分析

原汁、酵母發酵汁、酵母+乳酸菌發酵汁揮發性風味物質主成分對比分析見圖5。提取2 個主成分（主成分1：65.213%；主成分2：34.787%）可反映關鍵風味物質變化及樣品分布情況[16]。啤特果原汁主要分布在兩個主成分的負半軸，酵母菌發酵汁主要分布在主成分1 的正半軸，酵母菌+乳酸菌發酵汁主要分布在主成分2 的正半軸，大部分揮發性物質都分布在PC1 和PC2 的正向區間。其中原汁中主要反映甲酸辛酯、棕櫚酸異丙酯等風味物質特征，酵母菌發酵階段主要反映辛酸乙酯、3-羥基己酸乙酯、棕櫚酸乙酯和 3-羥基丁酸乙酯等風味物質特征，其中2-十六醇、正丁醇、七聚乙二醇等醇類化合物貢獻較大，乳酸菌發酵階段主要反映甲酸松油酯、3,4,4-三甲基-3-戊醇、3,4,5-三甲基-4-庚醇和庚酸等風味物質特征，其中甲酸松油酯、山梨酸乙烯酯、大馬士酮等化合物貢獻較大。不同菌種發酵所測的揮發性風味物質各有特點，使啤特果汁的風味有了很大的提高。

圖5 發酵前后揮發性物質主成分分析因子載荷圖

3 討論

揮發性風味物質種類和含量是反映果汁口感的重要指標，微生物代謝產生不同種類的物質，是改變揮發性風味物質種類和含量的有效手段。目前，揮發性風味物質提取方法有熱脫附[17]、溶劑萃取法[18]、超臨界流體萃取法和水蒸氣蒸餾法[19]以及超臨界流體萃取法[20]等，這些方法對于樣本測定是有效的，但也存在操作復雜、分析成本高等不足，HS-SPME 是一種新型樣本制備技術，適合復雜樣本的快速分析[21]。為了掌握啤特果汁經不同菌種發酵對其揮發性風味物質的影響，本實驗采用HS-SPME 和氣相色譜-質譜聯用技術對啤特果汁發酵前后揮發性風味物質的變化進行檢測和分析，簡化樣本處理過程，縮短分析時間，為果汁飲料的開發和品質控制提供高效檢測手段和 技術。

本試驗研究發現，啤特果的原汁中共有37種揮發性風味物質，這與魏晉梅等[22]測定的啤特果果實中含有的揮發性風味物質結果接近。當啤特果繼續發酵，果汁中揮發性風味物質的種類和含量明顯增加，這與劉佳奇等[9]、王麗萍等[10]研究果汁飲料發酵前后揮發性風味物質分析結果相似。這可能是因為果汁經過發酵生成醇類物質，乳酸菌發酵生成酸類物質，并通過酯化反應生成種類豐富的酯類物質。本試驗中發酵后揮發性物質酯類、醇類和酮類含量增加明顯，醛類變化較小，酸類和其他類含量基本無變化。其中酯類揮發性物質賦予啤特果汁濃郁的果香、花香和甜香，如甲酸松油酯、乙酸松油酯賦予果汁清甜香氣，有檸檬和柑橘香型香氣。本試驗還發現，啤特果發酵后醇類和酮類物質明顯增加，醇類是酵母菌發酵的主要代謝產物，其主要呈現出清新的花草香氣，如苯乙醇賦予果汁清甜的玫瑰花香，酮類物質中以3,4-二甲基-1,2-環戊二酮含量增加較為明顯。這些揮發性風味物質的協同作用使啤特果汁發酵香渾然一體，賦予了啤特果發酵汁飲料獨特的風味。

4 結論

本研究采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜技術對啤特果果汁發酵過程中揮發性風味物質的變化規律進行了分析。啤特果果汁經酵母菌發酵后揮發性風味物質種類增加了12種，經乳酸發酵后增加了15種。發酵后揮發性風味物質以酯類物質和醇類物質居多。主成分分析表明，發酵處理對啤特果汁的揮發性成分存在一定的影響，且不同菌種發酵處理對啤特果發酵汁的揮發性成分所起的作用不同，為啤特果汁新產品的開發提供了依據。