液相色譜-質譜/質譜串聯法測定番茄醬中六種紅曲色素

◎ 王 震

（諾安實力可商品檢驗（上海）有限公司，上海 201112）

紅曲色素是以大米或大豆為主要原料，由曲霉屬中的紅曲霉、變紅紅曲霉、紫紅紅曲霉和馬米加紅曲霉等菌種發酵提取后得到的一種天然色素，為深紫紅色粉末，其中已知成分包含紅、黃、橙3種色系10種化合物。作為一種天然的食品色素添加劑，紅曲色素在食品中少量的添加對人體危害較小，性甘、溫、無毒，并且具有利于消化、降脂、活血等功效，除了可作為著色劑使用，還具有一定的抗菌作用。有研究表明其對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、灰色鏈霉菌以及大腸桿菌具有一定的抑制作用。紅曲色素中含有多種化合物，在水及醇等有機試劑中都具有溶解性，且化學性質穩定。本次試驗針對其中6種化合物，包括潘紅胺、紅曲紅胺、紅曲素、紅斑素、紅曲黃素以及紅曲紅玉素進行研究，結構式見圖1。

圖1 6種紅曲色素結構式圖

目前國內針對食品中紅曲色素的測定方法不多，且方法中可參考測定的目標化合物較少，紅曲色素的添加量在食品添加劑使用標準中有限量要求[1-3]。目前，國內紅曲色素檢測方法有液相色譜法和液相色譜-質譜法兩種。液相色譜法是目前使用較多的方法，但其抗基質干擾能力差，前處理操作步驟煩瑣，耗時費力，化合物的靈敏度和準確性低于質譜法[4-7]。本文通過提取液直接提取，節約了樣品前處理時間，提高檢測效率。利用反相C18色譜柱分離番茄醬中的潘紅胺、紅曲紅胺、紅曲素、紅斑素、紅曲黃素以及紅曲玉紅素6種成分，通過優化液相流動相的梯度洗脫程序以去除基質中的雜質干擾、改善色譜峰峰型，并用質譜檢測器在正離子模式下多反應監測測定其含量，為食品安全的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗原理

測試原理參考《出口食品中紅曲色素的測定》 （SN/T 3843—2014）[1]，番茄醬中的紅曲色素用乙腈水溶液分別提取其中的水溶性色素及脂溶性色素，離心過濾后待上機。用標準加入法，在空白的樣品基質中加入不同濃度的標準品，并用相同的提取方法提取溶液用以制作標準曲線，用LC- MS/MS 測定確認。使用標準品線性的最低點、中間點、最高點濃度加標3 平行并重復測試兩天，同時測定樣品空白，以驗證試驗的重復性、重現性與定量限。

1.2 試劑與標準品

潘紅胺（Rubropunctamine）標準品：有證標準品，分子式為C21H23NO4，純度≥95%，CAS 514-66-9，購自Carbosynth；紅曲紅胺（N-Fmoc-8-aminooctanoic acid）標準品：有證標準品，分子式為C23H27NO4，純度≥99%，CAS 126631-93-4，購自上海安普實驗科技；紅曲素（Monascin）標準品：有證標準品，分子式為C21H26O5，純度≥98%，CAS 21516-68-7，購自成都樂美天醫藥科技；紅斑素（Rubropunctatin）標準品：有證標準品，分子式為C21H22O5，純度≥ 95%，CAS 514-67-0，購自深圳東方藍泰科技；紅曲黃素（Ankaflavin）標準品：有證標準品，分子式為C23H30O5，純 度≥98%，CAS 50980-32-0，購 自Carbosynth；紅曲玉紅素（Monascorubrin）標準品：有證標準品，分子式為C23H26O5，純度≥94%，CAS 13283-90-4，購自深圳東方藍泰科技；乙腈、甲酸，色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；水，二級水（GB/T 6682—2008）。

1.3 儀器與設備

本試驗用到的主要儀器與設備見表1。

表1 儀器與設備表

1.4 試驗方法

1.4.1 樣品提取

稱量10.0 g 番茄醬樣品于50 mL 離心管中。加入40 mL 乙腈水（v∶v=9 ∶1）提取液，漩渦混勻后，置于臺式振蕩器中振蕩1 h。置于高速離心機中于 4 000 r·min-1離心10 min 后，將上清液轉移至100 mL容量瓶，再次加入適量乙腈水（v∶v=9 ∶1）提取液重復提取樣品兩次，合并提取液至100 mL 容量瓶中，用乙腈水定容至刻度。取上清液過膜后待液相色譜串聯質譜儀上機分析。

1.4.2 紅曲素混合標準溶液制備

取5 份空白樣品，分別加入10 mg·L-1標準品混合 溶 液0.300 mL、0.200 mL、0.100 mL、0.050 mL、 0.025 mL 和0.010 mL 按樣品前處理操作進行提取，過膜后得到0.001 ～0.030 mg·L-1的混合標準工作溶液。

1.4.3 儀器條件

液相條件：流動相梯度程序見表2；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL·min-1；離子源模式：ESI+，多反應監測，MRM；離子源溫度：325 ℃；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：10 L·min-1；離子源噴霧電 源：5 500 V；色譜柱：ChormCore C18（2.1 mm×150 mm，3 μm）。納譜分析，質譜條件見表3。

表2 梯度參考條件表

表3 6種紅曲色素質譜條件表

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水作為液相系統的流動相，用梯度洗脫方式在反相C18色譜柱中分離基質干擾和不同的目標物，初始流動相的比例以高水相為主（80%水相），后用梯度洗脫系統提高有機相比例使目標物在合適的時間出峰，結果發現色譜峰的峰型窄、沒有分叉和拖尾，見圖2。目標物全部出峰后用更高的有機相比例（90%有機相），可以有效去除基質中的雜質，防止干擾下一針的進樣圖譜。

圖2 6種紅曲色素標準物質色譜圖

對于質譜檢測器條件而言，由于本次試驗的6種目標化合物在離子源中的加電模式均為[M+H]+形式，在乙腈和水中加入微量的甲酸可以有效提高目標化合物的離子化效率和靈敏度。同時為了提高各個化合物的響應，在MS 信號采集時可以設定保留時間分段采集信號，每個化合物的采集信號可設定為（RT±0.5）min，各個化合物的最低點濃度的色譜峰均超過10 倍信噪比。在全部化合物出峰后將MS 進樣狀態設定成“waste”可以有效減少離子源和四極桿的污染。

2.2 標準曲線

根據色譜圖（見圖3），讀取色譜峰面積值，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。在0.001 0 ～0.030 0 mg·L-1濃度范圍內，6 個化合物的校準曲線的線性相關系數均滿足大于0.995 的要求[8]，說明線性在該定量范圍符合標準要求，具體見圖3。

圖3 6種紅曲色素基質匹配標準曲線圖

2.3 加標回收試驗結果

取番茄醬空白基質樣品，準確稱取10 份，一份不加入標準品作為基質空白，其他9 份分別在每份樣品中加入標準曲線范圍低、中、高濃度的標準溶液各3份，按照1.4.1 的試驗步驟測定樣品后，在液相色譜儀質譜檢測器上讀取峰面積，計算含量結果，線性同樣品前處理上機測定，通過兩天測定空白基質，樣品圖譜中6種紅曲色素沒有陽性峰，基質樣品中也沒有數值 （見表4），故基質對加標沒有干擾。通過3 個濃度點的基質加標并測試兩天，觀察兩天測試結果的回收率，對方法的重復性與重現性進行驗證，數據見表4。不同濃度的回收率的平均值均滿足80%～110%的要求，說明準確度符合標準要求[8]。基質每個加標水平的回收率的相對標準偏差滿足小于15%的要求，精密度符合標準要求[8]。

表4 基質加標回收結果表

2.4 檢出限

基質最低加標水平0.010 mg·kg-1能同時滿足準確度和精密度的要求，滿足測試標準的要求，故將最低加標值0.010 mg·kg-1作為此次驗證的檢出限，滿足食品中添加劑使用標準限量標準的最低含量要求[9]。

3 結論

從本次試驗結果可以看出采用液相色譜-質譜/質譜串聯法可以準確測定番茄醬中六種紅曲色素的含量，方法準確性和精密度均符合標準要求，檢出限也能符合國內添加劑使用量的要求。本文通過使用LC-MS/MS 方法解決了采用常規液相色譜檢測中前處理操作步驟煩瑣、抗干擾能力弱、靈敏度和準確性差的問題，并在國內檢測標準的基礎上新增了幾種目標化合物，不僅提高了檢測效率，還為國內對紅曲色素的研究提供參考。