制備富硒醬油的釀造方法研究

◎ 周萌萌，董修濤，付寒奇

（廣東廚邦食品有限公司，廣東 陽江 529800）

為了獲得富含有機硒的發酵醬油，各界學者通過不同方式進行研究[1]。通過富集富硒酵母提取有機硒來制備有機硒醬油；以魚蛋白為原材料，經過酶解發酵獲得富含氨基酸的基液，加入富硒酵母作為有機硒載體，生產富硒醬油。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：從亞硒酸鈉培養基中篩選普羅威登斯菌；廣東廚邦食品有限公司自培米曲霉、酵母菌群。

培養基：蛋白胨0.7%、氯化鈉溶液20%、瓊脂2.0%和亞硒酸鈉2.0%。

試劑：乙醇，濟寧博誠化工有限公司；鹽酸，廣東省東紅化工廠；硝酸，佛山市華希盛化工有限公司；甲苯，廣東光華化學有限公司和氫氧化鈉，天津市明亮化學試劑廠。

發酵原材料：東北非轉基因黃豆、小麥粉、食用鹽和水。

1.2 儀器與設備

KDC-2C 型微量凱式定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；3-18N 型臺式離心機，湖南恒諾儀器設備有限公司；紫外可見分光光度計UV5，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；GK-1 微量元素檢測儀，山東國康電子科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 主要工藝流程

醬油釀造工藝流程見圖1。對照組是采用現有發酵工藝，米曲霉與發酵菌群混合制曲發酵，獲得發酵醬油。實驗組是以現有發酵工藝為基礎，增加普羅威登斯菌混合制曲，獲得富硒發酵醬油。

圖1 醬油釀造工藝流程圖

1.3.2 理化指標測定

蛋白酶活力的測定參考《蛋白酶制劑》（GB/T 23527— 2009）；氨基酸態氮的測定參考《食品安全國家標準 食品中氨基酸態氮的測定》（GB 5009.235—2016）；總氮含量的測定參考《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5—2016），采用凱式定氮法；有機硒含量的測定參考《食品安全國家標準食品中硒的測定》（GB 5009.93—2017）。

1.3.3 風味化合物的測定

參考陳光靜[2]的方法，分析風味物質形成的階段及產生機理，并對各風味物質進行量化測量，為醬油風味物質研究提供重要參考。

1.3.4 氨基酸態氮和總氮含量的測定

依據相關國標檢測氨基酸態氮《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》（GB 5009.124—2016）和總氮《化學試劑 總氮量測定通用方法》（GB/T 609—2018） 檢測發酵產出天然油的含量。

1.3.5 有機硒含量的測定

實驗可根據（GB 5009.93—2017）方法，測出總硒；利用氫化物發生原子熒光光譜法測出無機硒含量；用總硒減去無機硒，最終得出有機硒含量。

1.3.6 有機硒抗氧化性測定

實驗以不同有機硒濃度、有機硒添加量以及氧化時間為影響因素，以色澤、形態、組織和滋味氣味為感官評價指標，驗證不同因素對延緩食物褐變的影響，并觀察蘋果切片的褐變時間及褐變程度，評估有機硒抗氧化效果。有機硒抗氧化實驗設計見表1，感官評分標準見表2。

表1 有機硒抗氧化實驗設計表

表2 感官評分標準表

2 結果與分析

2.1 不同醬酪發酵酶活力對比

由表3 可知，對照樣與實驗樣中α-淀粉酶活力沒有明顯差異（P＞0.05）；對照樣與實驗樣的中性蛋白酶活力沒有明顯差異（P＞0.05）；對照樣與實驗樣中酸性蛋白酶活力沒有明顯差異（P＞0.05）；對照樣與實驗樣中糖化酶活力沒有明顯差異（P＞0.05）； 谷氨酰胺酶可催化谷氨酰胺水解生成谷氨酸，在提升醬油的風味方面至關重要[3]。對照樣與實驗樣中谷氨酰胺酶活力存在顯著差異（P＜0.05），實驗樣中谷氨酰胺酶是對照組的1.5 倍。

表3 發酵醬酪各種酶活記錄表（單位：U·g-1）

2.2 氨基酸態氮和總氮含量的變化

由圖2 可知，實驗組采用3種微生物發酵，氨基酸態氮和總氮含量均優于對照組，且氨基酸態氮與總氮成正比例關系。

圖2 不同曲料混合氨基酸態氮、總氮變化情況圖

2.3 有機硒含量的變化

對照樣與實驗樣分別添加0.5 g·mL-1的亞硒酸鈉溶液，通過微生物發酵跟進原油中有機硒含量。由表4 可知，發酵醬油添加普羅威登斯菌的混合醬油中有機硒含量達到0.025 mg·kg-1，遠高于直接使用酵母菌、米曲霉混合發酵的有機硒含量0.013 mg·kg-1，發酵過程生產有機硒效率達到對照組的1.9 倍，存在顯著差異（P＜0.05）。

2.4 有機硒抗氧化性分析

由表5 可知，有機硒添加量對抗氧化性影響最大，其次為氧化時間和有機硒濃度。實驗得到的最優組合為A3B2C1，即有機硒濃度0.02 mg·kg-1，添加量5 mL，氧化時長5 min，該組合感官得分最高（97.4 分），抗氧化效果最好。另有文獻表明，提高植物GSH-Px、GR、GST 和APX 等抗氧化物酶的活性以及非酶類抗氧化物質如AsA、GSH 等的含量，AsA-GSH 循環體系可提升自身抗氧化能力，這是市面上部分植物在切割后仍能在較長時間內保持新鮮的原因[4-5]。

2.5 風味化合物含量的變化

由表6 可知，實驗組風味物質較多，達到49種，與對照組相比，醇類、醛類和吡嗪類物質種類較多對照組，實驗組感官風味醇厚濃郁，主要與發酵環節添加富硒酵母活性較高有關。添加普羅維登斯菌、米曲霉和酵母菌混合培養的醬酪在醇類、醛類、吡嗪類物質種類較多僅用米曲霉、酵母菌混合培養的發酵醬油。

表6 風味化合物的記錄表

3 結論

有機硒醬油產品發酵環節，添加普羅維登斯菌分解無機亞硒酸鈉后，經米曲霉、酵母菌群發酵獲得的有機硒含量遠高于直接將無機納米硒采用米曲霉、酵母菌群發酵的醬油原油。分析兩種方案理化特性，實驗組谷氨酰胺酶含量較高，更有利于轉化生產谷氨酸，提升氨基酸態氮利用率。實驗組將無機亞硒酸鈉經過分解納米化，發酵醬油轉化的有機硒含量為對照組的1.9 倍，說明經微生物分解后的無機納米硒更有助于發酵生成有機硒。從風味物質種類分析，實驗組能夠產出更多風味物質，發酵醬油的綜合風味更佳濃郁，產出醬油品質更佳。