常用補血中藥對于血虛證的影響

王芳 馬威

血虛證是中醫臨床常見證候，主要是由于血液生化不足及血液耗損過多而致血液虧虛，不能濡養臟腑、經絡、組織，是以面、瞼、唇、舌色淡白，脈細為主要臨床表現的一系列虛弱表現證候的總稱，涉及心、肺、肝、脾、腎等臟器，可見于臨床各種慢性疾病的辨證中，如冠心病、各種貧血、糖尿病、慢性腎臟疾病后期、腦梗死后遺癥等多種疾病。依據虛者補之的原則，臨床又有益氣補血，滋陰補血、補血活血等不同治則，補血作用的藥物和處方也多，如四物湯、炙甘草湯、當歸生姜羊肉湯、小建中湯等；而藥物則更加繁多。如何選擇用藥，以發揮較好或者更佳療效，對臨床醫師來說是一個需要思考且亟待解決的問題。故筆者選擇了臨床常用的多味補血中藥，從補血的作用出發，探討這些中藥在補血方面的功效優劣，并探討其作用機制，為臨床用藥和中醫理論的發展提供一個思路。

1 材料與方法

1.1 一般材料

SPF級120只4周齡KM小鼠，雄性，22～25 g，購于湖北省實驗動物中心，動物合格證號：No.00017793。本動物實驗方案經武漢市中西醫結合醫院動物中心進行動物實驗倫理審查合格（且取材前動物須經腹腔注射戊巴比妥麻醉）。動物實驗完成于武漢市中西醫結合醫院SPF動物室，實驗動物設施使用證號：No.00022894。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑 小鼠促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）ELISA Kit，武漢博士德（EK0333）白細胞介素-3（IL-3）ELISA Kit，武漢博士德（EK0403）。

1.2.2 實驗設備 儀器設備血球分析儀Sysmex-2000iV（Sysmex Corporation，日本）。

1.2.3 實驗藥物 中藥阿膠、當歸、白芍、大棗、丹參、制首烏、熟地、桑葚、龍眼肉等，均購自武漢市中西醫結合醫院，由湖北中醫藥大學藥學院鑒定。分別取當歸、白芍、大棗、丹參、制首烏、熟地、桑葚、龍眼肉各50 g于燒杯中，加去離子水120 ml，浸泡30 min；第一煎（大火煎開，轉小火20 min，然后多層紗布過濾，濾液保留備用）；第二煎（第一煎之藥渣中加入80 ml去離子水，大火煎開，轉小火20 min，然后多層紗布過濾）；合并2次濾液，于小火上濃縮至83 ml（含生藥濃度0.6 g/ml）。取阿膠50 g，隔水蒸至完全溶解，定容至83 ml（含生藥濃度0.6 g/ml）。藥物對照選擇常用的補血劑四物湯（《太平惠民和劑局方》）：當歸10 g，川芎8 g，白芍12 g，熟地12 g。加水100.8 ml浸泡后，按上述方法煎煮，最后濃縮至70 ml（含生藥濃度0.6 g/ml）備用。

1.2.4 實驗方法 （1）血虛模型[1]的建立：KM小鼠，適應性喂養1周后，經210 Gy60Co一次全身照射制備模型。（2）實驗分組及干預治療：120只KM小鼠，適應性喂養1周后，隨機分為12組，分別為模型組、空白組、阿膠組、白芍組、大棗組、丹參組、當歸組、龍眼肉組、熟地組、制首烏組、桑葚組及藥物對照組，每組10只。實驗第1天，上午各中藥組及藥物對照組分別灌胃各自中藥[劑量為100 mg/（kg·d）]，模型組及空白組灌胃同等體積的蒸餾水；下午除空白組外，其他各組動物經210 Gy60Co一次全身照射造模。各組動物連續灌胃10 d。最后一次灌胃2 h后，各組動物腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）麻醉，再采血、取腎組織標本備用。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 比較各組體重、血紅蛋白（Hb）、紅細胞數量（RBC）、血細胞比容（HCT），均由儀器檢測。

1.3.2 血清EPO、IL-3檢測 比較12組血清EPO、IL-3水平，嚴格按說明書要求采用ELISA法檢測EPO、IL-3含量（準備試劑和標準品；每孔添加100 μl樣品和標準品，37 ℃反應90 min，不洗；每孔添加100 μl生物素標記抗體，37 ℃反應60 min；0.01 M TBS洗滌 3次；每孔添加 100 μl ABC，37 ℃反應30 min；0.01 M TBS洗滌5次；TMB 37 ℃避光反應30 min以內；加入TMB終止液，酶標儀上讀數；繪制標準曲線并計算各樣本含量）。

1.3.3 RT-PCR檢測腎組織促紅細胞生成素受體（EPOR）mRNA表達 比較各組腎組織EPOR mRNA表達水平，以Trizol提取總mRNA，逆轉錄后PCR擴增，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀上進行灰度（IOD）掃描分析，利用相應的β-actin灰度值為參照，以與其比值表示各組各指標mRNA表達的相對強弱。PCR擴增引物合成于上海生工公司，β-actin引物：上游5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，下 游5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3，產物長度240 bp，退火溫度56 ℃，30個循環；EPOR引物：上游 5’- ACACTGGGGAGTGACTCAGG-3’，下游 5’-CATCCATAGTCGCAGGGTCT-3’，產物長度 180 bp，退火溫度56 ℃，30個循環。

1.4 統計學處理

本研究數據采用SPSS 18.0統計學軟件進行分析和處理，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組體重、Hb、RBC、HCT比較

與空白組比較，模型組體重、HCT、Hb、RBC均較低（P=0.000）。與模型組比較，藥物對照組體重、HCT、Hb、RBC均較高（P=0.000），各單味中藥組（除桑葚組外）體重、HCT、Hb、RBC均較高（P<0.05）。與藥物對照組比較，丹參組體重較低（P<0.05），其余各單味中藥組與藥物對照組體重、Hb、RBC、HCT比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 各組體重、Hb、RBC、HCT比較（±s）

表1 各組體重、Hb、RBC、HCT比較（±s）

*與空白組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.05；△與模型組比較，P<0.01；▲與藥物對照組比較，P<0.05。

組別 體重（g） HCT（%） Hb（g/L） RBC（×1012/L）空白組（n=10） 35.24±1.66 45.98±2.42 120.12±8.90 7.19±0.39模型組（n=10） 30.14±0.49* 36.60±3.14* 93.25±8.38* 5.53±0.49*藥物對照組（n=10） 35.26±2.12△ 48.68±5.20△ 127.10±10.02△ 7.26±0.46△阿膠組（n=10） 33.33±3.18# 44.56±3.46△ 119.56±11.17△ 7.02±0.67△白芍組（n=10） 32.99±2.41# 47.22±3.07△ 124.11±7.90△ 7.38±0.57△大棗組（n=10） 33.59±2.31△ 48.43±2.95△ 126.22±8.14△ 7.50±0.50△丹參組（n=10） 32.99±1.64△▲ 46.07±2.37△ 117.22±9.04△ 7.13±0.50△當歸組（n=10） 33.34±1.60△ 45.58±1.60△ 119.62±7.95△ 7.05±0.36△龍眼肉組（n=10） 34.19±2.28△ 43.89±3.42△ 112.71±9.86△ 6.69±0.50△桑葚組（n=10） 32.16±3.16 45.74±1.56△ 118.56±6.09△ 7.11±0.37△熟地組（n=10） 34.29±3.17△ 44.99±3.98△ 122.33±15.54△ 6.99±0.63△制首烏組（n=10） 30.84±1.90△ 46.72±2.80△ 120.44±6.04△ 7.39±0.38△F值 2.991 1.161 2.260 2.991 P值 0.004 0.338 0.026 0.004

2.2 各組血清EPO、IL-3水平比較

與空白組比較，模型組血清IL-3、EPO含量均高（P<0.05）。與模型組比較，阿膠、白芍、丹參、當歸、龍眼肉、桑葚組血清IL-3含量均低（P<0.05），大棗、熟地、制首烏組雖低，但差異均無統計學意義（P>0.05）。與藥物對照組比較，當歸組血清IL-3含量低（P<0.05）。另外，與模型組比較，藥物對照、阿膠、丹參、龍眼肉組血清EPO含量均低（P<0.05），白芍、桑葚、大棗、當歸、熟地、制首烏組血清EPO含量與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。與藥物對照組比較，阿膠組血清EPO含量低（P<0.05），大棗、當歸、熟地、制首烏組血清EPO含量均高（P<0.05），見表2。

表2 各組血清EPO、IL-3水平比較[pg/ml，（±s）]

表2 各組血清EPO、IL-3水平比較[pg/ml，（±s）]

*與空白組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05；△與模型組比較，P<0.01；▲與藥物對照組比較，P<0.05；▽與藥物對照組比較，P<0.01。

組別 IL-3 EPO空白組（n=10） 74.03±12.85 117.27±13.56模型組（n=10） 87.23±11.51* 131.27±11.41*藥物對照組（n=10） 72.70±10.79# 118.01±5.20#阿膠組（n=10） 66.04±9.50△ 108.79±9.50#△▲白芍組（n=10） 62.22±9.60△ 119.23±12.80大棗組（n=10） 78.02±20.60 144.00±15.80▽丹參組（n=10） 71.05±8.90△ 101.72±21.37#△當歸組（n=10） 51.80±21.88△▲ 143.62±18.97▽龍眼肉組（n=10） 62.62±13.22△ 112.07±15.74#桑葚組（n=10） 70.73±11.95#△ 124.52±12.26熟地組（n=10） 73.22±20.66 138.47±18.59▲▽制首烏組（n=10） 85.42±11.34 145.26±16.87▽F值 14.796 17.508 P值 0.000 0.000

2.3 各組腎組織EPOR mRNA表達比較

與空白組比較，模型組腎組織EPOR mRNA表達低（P<0.01）。與模型組比較，藥物對照組、阿膠組、白芍組、大棗組、丹參組、當歸組、龍眼肉組、桑葚組、熟地組、制首烏組腎組織EPOR mRNA表達均高（P<0.05）。與藥物對照組比較，阿膠、白芍、當歸、熟地、制首烏組腎組織EPOR mRNA表達低（P<0.05），大棗、丹參、龍眼肉、桑葚組腎組織EPOR mRNA表達比較差異無統計學意義（P>0.05），見表3、圖1。

圖1 12組腎組織EPOR mRNA表達比較

表3 各組腎組織EPOR mRNA表達比較（±s）

表3 各組腎組織EPOR mRNA表達比較（±s）

*與空白組比較，P<0.01；#與模型組比較，P<0.05；△與模型組比較，P<0.01；▲與藥物對照組比較，P<0.01。

組別 EPOR mRNA空白組（n=10） 1.290±0.110模型組（n=10） 0.668±0.073*藥物對照組（n=10） 1.205±0.113△阿膠組（n=10） 0.785±0.084#▲白芍組（n=10） 1.045±0.082△▲大棗組（n=10） 1.121±0.092△丹參組（n=10） 1.017±0.093△當歸組（n=10） 0.775±0.065#▲龍眼肉組（n=10） 1.106±0.097△桑葚組（n=10） 1.084±0.113△熟地組（n=10） 0.917±0.083△▲制首烏組（n=10） 0.806±0.067△▲F值 13.521 P值 0.000

3 討論

3.1 中藥對貧血基本指標的影響

血虛證是血液虧虛，臟腑百脈失養，而表現全身虛弱的證候[2-3]。中醫血虛證不單純屬某一疾病，而是表現于臨床各科的多種疾病過程中，可見于現代醫學的缺鐵性貧血、再生障礙性貧血、溶血性貧血、白血病等各種失血疾病。臨床主要表現為面色無華，口唇淡白，肌膚蒼白灰暗；情志方面，容易驚惕不安，有莫可名狀的恐懼感等；視力減弱，視物昏花，目不精明；女性可見月事漸少以致不來；脈見虛而無力之象。血虛主要有化源不足和失血過多兩個方面造成，故虛者補之，治療主要在于養血補血。目前臨床各種原因所致貧血均可辨證歸屬血虛證，故筆者用單味藥物治療血虛證模型動物，觀察不同單味補血中藥的功效優劣及其對造血調控的影響。

中藥學課本中記載補血藥有白芍、熟地、制首烏、阿膠、當歸、丹參、龍眼肉等，另外，在臨床大棗與桑葚也常用于補血。這些常用中藥雖然性味功效各有側重，但均有補血作用。藥典中記載，白芍，性微寒，味苦酸，平肝止痛，養血調經；阿膠，味甘，性平，歸肺、肝、腎經，補血滋陰，潤燥，止血；大棗，味甘性溫，補中益氣，養血安神；丹參，味苦，微寒，歸心肝經，活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰；當歸，甘，辛，溫，歸肝、心、脾經，補血活血，調經止痛，潤腸通便；龍眼肉，甘，溫，歸心、脾經，補益心脾，養血安神；桑葚，甘，酸，寒，歸心、肝、腎經，滋陰補血，生精潤燥；熟地，甘，微溫，歸肝、腎經，補血滋陰，益精添髓；制首烏，苦，甘，澀，微溫，歸肝、心、腎經，補肝腎，益精血，烏須發，強筋骨，化濁降脂。丹參、當歸，活血補血；阿膠、白芍、熟地、桑葚、制首烏，滋陰補血；大棗補血和中；龍眼肉補心養血。以上諸藥，均可補血，用于血虛證的治療。

實驗結果提示，與模型組比較，藥物對照組體重、HCT、Hb、RBC均較高（P=0.000），各單味中藥組（除桑葚組外）體重、HCT、Hb、RBC均較高（P<0.05），表明，四物湯及白芍、阿膠、丹參、大棗、當歸、龍眼肉、桑葚、熟地、制首烏中藥組均可改善小鼠貧血。與藥物對照組比較，丹參組體重較低（P<0.05），其他各單味中藥組體重、HCT、Hb、RBC與藥物對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）。本實驗結果與既往研究報道文獻[4-10]結果一致，均提示常用中藥白芍、熟地、大棗、當歸、制首烏等可改善貧血。

補血藥物從血紅蛋白均值水平來推斷，功效由強到弱依次為大棗>白芍>熟地>制首烏>當歸>阿膠>桑葚>丹參>龍眼肉。上述中藥均可補血，白芍、熟地、制首烏益腎補血作用最強；阿膠、當歸、丹參、桑葚臨床最為常用，作用平和；大棗調和諸藥，實驗中功效位列首位，可能與其劑量有關，其臨床應用廣泛，通常劑量輕微，主要作為佐藥應用，大棗重用主要在于補血[7]；龍眼肉主要滋陰補血，補血力量最弱。

血虛證產生原因包括有外感六淫、內傷七情及瘀血，其均可導致內血耗損而血虛，與心、肝、腎密切相關。除大棗外，制首烏補腎益精血，在常用補血藥物中對紅細胞的改善作用最為顯著，數值最高。腎為先天之本，腎主骨生髓，腎精、腎氣、腎陰、腎陽及津液在血液的生成中發揮重要作用，因此腎臟病變可影響血的生成而導致血虛證，提示臨證治療血虛證時可從腎臟論治：填精益髓以資血，補益腎氣以養血，滋腎陰溫腎陽以生血[11]。故實驗結果提示制首烏補血效果較好。

3.2 對造血調控的影響

血虛是臨床常見病癥，多由于生血乏源、失血過多、腎精虧損、大病等引起，目前對血液癥的研究主要集中于臨床體征、血細胞功能、免疫功能、骨髓造血功能的改變等有關方面。放射損傷也是目前各種免疫抑制模型制備的方法之一，它可以使得免疫器官萎縮、抑制造血系統的功能。是目前建立血虛模型的主要方法之一。模型可以表現出貧血的基本特征，如紅細胞減少、血紅蛋白下降、血細胞比容降低等，貧血是判定血虛模型成功的主要指標。

中藥改善貧血機制涉及造血調控的多個環節。EPO是紅細胞生成的關鍵調節因子。腎臟的間質管周細胞（IPC）在成年期產生和分泌EPO。同時EPO作用于肽激素和造血生長因子（HGF），刺激骨髓紅細胞生成。EPO的產生由缺氧激活，并通過氧敏感反饋回路進行調節。EPO通過其同型二聚體EPOR起作用，該受體可增加細胞存活率并驅動祖細胞BFU-E和CFU-E的終末紅細胞成熟為數十億成熟紅細胞[12]。紅細胞祖細胞（BFU-E/CFU-E）的體內生成基本上受多種因素控制，包括糖皮質激素、炎癥和壓力。此外，只有通過外部信號（如促紅細胞生成素、SCF、IL-3和與細胞外基質蛋白的相互作用）協調調節紅細胞祖細胞的終末增殖和分化，才能定期產生功能成熟/可輸注的紅細胞單位[13]。本實驗中，與空白組比較，模型組血清IL-3、EPO含量均高（P<0.05），提示貧血刺激了IL-3、EPO的分泌。與模型組比較，阿膠、白芍、丹參、當歸、龍眼肉、桑葚組血清IL-3含量均低（P<0.05），大棗、熟地、制首烏組雖有降低，但比較差異無統計學意義（P>0.05）。與藥物對照組比較，當歸組血清IL-3含量低（P<0.05）。提示各中藥治療組并沒有增加IL-3的分泌。另外，與模型組比較，藥物對照、阿膠、丹參、龍眼肉組血清EPO含量均低（P<0.05），白芍、桑葚、大棗、當歸、熟地、制首烏組血清EPO含量與模型組比較差異無統計學意義（P>0.05）。與藥物對照組比較，阿膠組血清EPO含量低（P<0.05），大棗、當歸、熟地、制首烏組血清EPO含量高（P<0.05）。結果顯示，各中藥改善貧血并不是均可提高EPO、IL-3的分泌。與空白組比較，模型組腎組織EPOR mRNA表達低（P<0.01）。與模型組比較，藥物對照組、阿膠組、白芍組、大棗組、丹參組、當歸組、龍眼肉組、桑葚組、熟地組、制首烏組腎組織EPOR mRNA表達均高（P<0.05），提示，中藥補血雖可刺激EPOR mRNA的表達，但EPO的表達與其并不一致，故作用并不是刺激EPO、IL-3的分泌，另有其他影響機制。

治療時間短暫，可能是療效不顯著的原因之一；另外，各中藥作用途徑可能不同，本實驗僅是一個探索。中藥改善血虛作用機制復雜，中藥劑量大小、作用時效等均會對其功效的發揮構成影響，其對造血調控的影響還需要進一步探索。