免疫組織化學技術在子宮頸上皮內病變中的應用價值分析

黃秋梅 洪美玲

子宮頸癌（cervical cancer）是威脅女性健康安全最嚴重的疾病之一，是女性惡性腫瘤發病率的第二位[1]。通常而言，子宮頸癌潛伏期長，需要經歷從低級別鱗狀上皮內病變（low squamous intraepithelial lesions，LSIL）至高級別鱗狀上皮內病變（high squamous intraepithelial lesions，HSIL）才會轉化為早期癌，再轉化為浸潤癌[2]。而在SIL時期，也為宮頸上皮內瘤樣病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）時期進行治療的5年內存活率為100%，這足以說明在SIL時期進行篩查、治療的重要性。但不同SIL時期需要的治療方法不同，如LSIL時期大部分無須治療，可以自行好轉，而HSIL時期就需要進行治療，所以如何準確有效地檢測出SIL等級有急迫的現實意義。有研究顯示，應用免疫組織化學技術檢測于子宮頸上皮內病變效果突出[3]。為進一步研究其具體應用價值，特展開免疫組織化學技術應用于子宮頸上皮內病變中的價值分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集泉州市婦幼保健院·兒童醫院自2019年2月-2020年10月宮頸活檢或LEEP刀錐切標本163例，納入標準：已婚婦女，術前宮頸活檢病理檢查確定存在宮頸鱗狀上皮內病變，患者無嚴重重要臟器疾病。排除標準：合并其他手術，病理診斷為炎癥或癌變，臨床資料不完整。其中133例子宮頸上皮內病變患者為觀察組，按照級別不同分為低級別鱗狀上皮內病變（LSIL）組45例和高級別鱗狀上皮內病變（HSIL）組88例。30例子宮肌瘤全切子宮的正常宮頸患者為對照組。LSIL組年齡35～70歲，平均（45.39±2.95）歲；HSIL組年齡33～71歲，平均（45.67±3.12）歲；對照組年齡32～69歲，平均（46.53±3.27）歲。三組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），有可比性。

1.2 方法

所有切片標本使用中性福爾馬林（10%）[蘇州瑞諾德生物科技有限公司，蘇錫食藥監械（準）字2014第1410004號，500 ml/瓶]固定，石蠟包埋，采用常規厚度4 μm連續切片。常規HE染色及染色免疫組化EnVision法標記，使用光鏡觀察細胞形態，進行診斷和分級[4]。所用抗體為p16、p53、p63及Ki-67的鼠單克隆抗體，試劑盒為邁新公司產品，嚴格參照試劑盒說明書和相關單克隆抗體參考文獻[5-6]使用。切片經由具有多年操作經驗的兩位病理醫師重新對SIL進行分級處理，確保結果無誤。具體方法：（1）將石蠟切片放于新鮮二甲苯中浸泡10 min，浸泡2次后將去除多余液體，后分別浸泡于85%、95%及無水乙醇中，各浸泡5 min后利用蒸餾水沖洗1 min。（2）將普通水浴鍋預熱至95 ℃～100 ℃，后將已浸泡于抗原修復液的切片在此鍋內加熱20 min，并依據不同樣品、目的蛋白合理控制最佳加熱時間，20 min后冷卻切片，并用免疫染色條洗滌劑洗滌5 min，洗2次。（3）使用蒸餾水沖洗修復后切片1 min，利用油筆固定玻片上待測組織區域，并加入100 μl的內源性過氧化酶封閉劑，置于室溫下孵育5 min，后行TBS溶液沖洗3 min，分別沖洗3次。（4）去除TBS溶液后再次加入100 μl一抗，于4 ℃條件下進行1 h孵育，后加入抗小鼠/免過氧化物酶聚合物。（5）將TBS溶液取出后加入新鮮配制DAN顯色液，于室溫下進行5 min孵育，利用蒸餾水沖洗后加入100 μl蘇木素，于室溫下孵育8 min，后進行脫水、透明、封片。

1.3 觀察指標及評價標準

閱讀試劑盒產品說明及單克隆抗體相關文獻，p16陽性表達為胞核和/或胞漿著色，見圖1。細胞核出現棕色顆粒為p53、p63及Ki-67的陽性表達，見圖2、表1。

表1 抗體的強度表達

圖1 p16強陽性表達（HE染色放大40倍）

圖2 p53、p63、Ki-67強陽性表達（HE染色放大40倍）

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，正態分布的計量資料采用（±s）表示，非正態分布的計量資料轉化后采用（±s）表示，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料以率（%）表示，數據比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組p16免疫組化染色結果比較

p16在對照組中染色結果全部呈陰性（-），LSIL組中75.56%呈弱陽性（+），HSIL組62.50%呈中陽性（++），三組染色結果比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表2 三組p16免疫組化染色結果比較[例（%）]

2.2 三組p53免疫組化染色結果比較

p53在對照組染色結果全部呈陰性（-）；LSIL、HSIL組84.44%、61.36%呈中陽性（++）；三組染色結果陰性（-）、中陽性（++）、強陽性（+++）比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

表3 三組p53免疫組化染色結果比較[例（%）]

2.3 三組p63免疫組化染色結果比較

p63的強度表達在對照組中染色結果全部呈陰性（-）；LSIL中82.22%呈陰性（-）；LSIL組陰性（-）率高于HSIL組（P<0.05）；三組染色結果比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表4。

表4 三組p63免疫組化染色結果比較[例（%）]

2.4 三組Ki-67免疫組化染色結果比較

Ki-67在對照組的免疫組化染色結果為陰性（-）；在LSIL組中77.78%呈弱陽性（+），HSIL組中80.68%呈中陽性（++）；三組染色結果陰性（-）、弱陽性（+）、中陽性（++）的表達，差異有統計學意義（P<0.05）；三組染色結果強陽性（+++）表達，差異無統計學意義（P>0.05），見表5。

表5 三組Ki-67免疫組化染色結果比較[例（%）]

2.5 三組p16、p53、p63、Ki-67陽性率比較

p16、p53、p63、Ki-67在對照組中的陽性率均為0，p16、p63、Ki-67在HSIL組中的陽性率均高于LSIL組（P<0.05）；三組p53陽性率比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表6。

表6 三組p16、p53、p63、Ki-67陽性率比較（%）

3 討論

在目前的臨床治療中，子宮頸上皮內病變有著兩種截然不同的結局，或是自然消退，并不影響健康，或是逐步發生病變，由CIN1發展至CIN2、CIN3，直至早期癌、浸潤癌，嚴重威脅身體健康[7-9]。由于子宮頸上皮內病變潛伏期長，在CIN時期進行治療可得到較好的效果，預后情況良好，所以為避免子宮頸癌威脅到女性的身體健康，提高子宮頸癌的早期篩查準確率有重要意義[10-11]。隨著免疫組織化學技術的飛速發展，國內外眾多學者使用免疫組織化學技術來檢測子宮頸上皮內病變程度，如石克等[12-13]，免疫組織化學技術的重要性越發凸顯。為觀察免疫組織化學技術在子宮頸上皮內病變的應用，本研究使用p16、p53、p63、Ki-67來檢測子宮頸上皮內病變的程度，分析其應用價值。

p16是一種直接參與細胞周期調控的基本基因，是一種抗癌基因，負責調節細胞的增殖與分裂，研究表明p16基因廣泛參與腫瘤形成，檢測p16基因可以有效預測子宮頸上皮內病變的程度[14]。p53是一種人體抑癌基因，在所有的惡性腫瘤中，一半以上都會出現p53基因的突變，同時p53基因在正常上皮的形成過程中有著重要作用，在上皮組織表達明顯[15]。p63同樣也是一種抑癌基因，p63在子宮頸上皮內病變的異常表達與缺失可作為SIL轉化的標志[16]。Ki-67對腫瘤細胞的增生活性有一定反應作用，是細胞增生的標記物，可以作為區分LSIL或是HSIL的輔助診斷指標[17]。而這四種判斷病變程度的指標都可以使用免疫組織化學技術進行測定，在本次研究中，30例子宮肌瘤全切子宮的正常宮頸在p16、p53、p63、Ki-67的染色測驗中結果全部呈陰性，這說明應用免疫組織化學技術可以很好地判斷子宮頸是否正常，初步篩查準確率極高[18]。p16、Ki-67在LSIL組中大部分呈弱陽性狀態，在HSIL組中大部分呈中陽性，隨著SIL的病變分級，陽性細胞數逐步增加。p53在LSIL、HSIL組中大部分呈中陽性表達，p63在LSIL中大部分呈陰性表達。并且p16、p53、Ki-67的在LSIL及HSIL組中的陽性率都極高，p53各個組別間比較，差異無統計學意義，p63在LSIL組中陽性率較低，差異有統計學意義。這充分表明四項指標對于子宮頸上皮內病變程度都有著一定的監測效果，可以通過免疫組織化學技術判斷其病變等級，對子宮頸上皮內病變的前期診斷和治療中有著重要作用，可以有效減少宮頸癌的發病率[19-20]。

綜合上述，免疫組織化學技術應用于子宮頸上皮內病變能在一定程度上檢測病變程度，減少宮頸癌的發生，值得臨床早期診斷與治療應用。