我國豬流行性腹瀉病毒流行現狀及分子遺傳演化特征

左媛媛，徐天剛，戈勝強，路皓東，吳曉東

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2.山東農業大學，山東泰安 271018）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）屬于冠狀病毒科甲型冠狀病毒屬，可引起豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED），導致患病豬腹瀉、嘔吐、厭食、脫水和體重減輕，并可導致哺乳仔豬大量死亡[1-2]。PEDV有囊膜，基因組為單股正鏈RNA，長度約28 kb，含有7 個開放閱讀框（ORFs），分別編碼2 個大的多聚蛋白（pp1a 和pp1b）、4 個結構蛋白[棘突蛋白（S）、膜蛋白（M）、囊膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）]和1 個附屬蛋白（ORF3）。S蛋白是三聚體糖蛋白，位于病毒粒子表面，在病毒粘附、受體結合以及病毒進入細胞時與細胞膜融合方面起重要作用[3-4]。S 蛋白分為N 端的S1 區和C端的S2 區，其中S1 區受到的免疫壓力大于S2 區，因此S1 區與PEDV 毒力有關，并且在免疫壓力下可快速突變。S 蛋白也是產生中和抗體的主要蛋白，目前已鑒定出至少5 個中和抗原表位：N 端的S10區（NTD/S10）、膠原蛋白酶等效區（COE）、S1D 區的SS2 和SS6、C 端的2C10。因此，S基因常用于PEDV 遺傳演化研究[5-6]。

PED 于1971 年首次在英國被報道，起初被命名為流行性病毒腹瀉（EVD）。1978 年，比利時科學家通過試驗證實了這種新發現的冠狀病毒可導致豬腹瀉，將其命名為CV777。1982 年，由該種病毒引起的仔豬腹瀉被規范命名為PED[7]。到2000年，PED 在歐洲得到基本控制，但在亞洲，其危害程度仍然較嚴重，中國、日本、韓國等國家都有PED 流行。2010 年末，一種新型高致病性PEDV引發的疫情在我國華南地區某豬場暴發，并很快擴散到全國。亞洲（日本、泰國、韓國、菲律賓等）和美洲（美國、加拿大、墨西哥等）等地區也暴發此類疫情，導致大量哺乳仔豬死亡，給全球養豬業造成嚴重經濟損失。2013 年PEDV 傳入美國后，造成占美國養豬總量10%的700 萬頭仔豬死亡；然而在歐洲（烏克蘭除外）、非洲以及澳大利亞沒有發現高致病性PEDV 流行[8]。本文將對PEDV在我國的流行特點及其遺傳演化關系進行綜述，以期為PED 的預防控制，特別是疫苗研制提供參考。

1 國內PED 流行特點

據文獻[9]報道，早在1973 年我國可能就有PED 流行。20 世紀80 年代早期到2010 年，PED在我國一直呈散發或地方性流行，未見類似日本和韓國的大流行。據不完全統計[10]，1987—1989 年全國26 個?。ㄗ灾螀^、直轄市）由PED 導致的死亡率占36 種豬病總死亡率的1.74%，而傳染性胃腸炎（TGE）占到9.53%。2004 年在廣西壯族自治區6個城市開展的調查[11]顯示：PED 發病率為42.00%（4 658/11 090），病死率為5.69%（265/4 658）；中小豬發病率為46.70%（4 302/9 212），病死率為6.16%（256/4 302）；母豬發病率為18.96%（356/1 878），沒有出現死亡。以上調查數據表明，PEDV 主要引起仔豬發病和死亡，而對成年母豬引起的發病率低，癥狀也不嚴重。調查資料[12]顯示：2005—2007 年仔豬發生PED 占仔豬腹瀉的46%。另一項研究[13]應用多重RT-PCR 方法，檢測2009—2010 年從全國多個省份采集的197 份仔豬腹瀉樣品，結果發現PEDV 陽性檢出率為29.44%（58/197）、TGEV 為0.51%（1/197）、豬輪狀病毒（PoRV）為7.61%（15/197）。上述結果表明，盡管PED 呈散發狀態，但PEDV 一度是引起我國仔豬腹瀉的主要病原之一。

2010 年10 月前，PEDV 滅活疫苗和弱毒疫苗的使用較好地控制了全國PED 的流行，但2010 年冬天，華南地區某豬場暴發新型高致病性PED 并很快傳遍全國，至少有29 個?。ㄗ灾螀^、直轄市）報道發生了PED 大流行。此次PED 暴發的特點是流行范圍廣，在發病地區幾乎波及所有養豬場，不僅在我國大面積流行，在美國、墨西哥、日本、韓國、越南、泰國等全球主要生豬產地也都有大面積流行。研究[14]顯示，2010—2011 年從華南、華東和華中地區9 個省份采集的600 多份豬組織和糞便樣品中檢測到的PEDV 平均陽性率為58.32%。2012 年，從全國12 個省份采集仔豬小腸組織和糞便樣品，用RT-PCR、膠體金等方法進行檢測，結果發現PEDV 感染率高達61.19%（134/219），顯著高于TGEV 和PoRV[15]。2011 年2 月—2014 年3 月，在全國29 個省份開展PED 流行病學調查[16]發現，樣品陽性率為61.10%～78.49%，場陽性率為71.43%～83.47%。2016 年，從全國17 個省份采集1 272 份樣品進行檢測，發現PEDV 陽性率為28.93%[17]。另外一項研究[18]則顯示，2012—2017年從全國15 個省份采集的1 542 份豬腹瀉樣品中，有1 235 份檢測為PEDV 陽性，陽性檢出率高達80.09%。具體到各省份情況來看：2013—2017年在云南省采集的435 份豬腹瀉樣品中，PEDV陽性檢出率為17.47%[19]；2014—2018 年從四川省和貴州省156 個豬場采集的645 份豬腹瀉樣品中，有84 個豬場檢測到PEDV，樣品陽性檢出率為35.81%[20]；2015—2019 年在河南省采集的575份豬腹瀉樣品中，PEDV 陽性檢出率為51.65%，其中2015 年（40.68%）到2017 年（39.29%）流行相對穩定，2018 年大幅度提高（74.19%）[21]；2017—2018 年，從湖南省39 個豬場采集的184份腹瀉樣品中，71.79%（28/39）的豬場檢測到PEDV，樣品陽性率為38.04%（70/184）[22]。2019 年，Chen 等[23]對PubMed、Google scholar、Cochrane library、Clinical Trials 以及中國知網和維普數據庫中有關我國大陸地區PEDV 流行的45 篇文章進行統計，時間跨度為1988 年1 月—2018 年8 月，結果發現PEDV 平均流行率為44%，其中北方地區為37%，低于其他地區。以上調查結果表明，自2010 年以來，PED 在我國大范圍流行，是導致仔豬腹瀉的主要疾病，嚴重危害我國養豬業健康發展。

2 仔豬PEDV 感染特征

2010 年以后流行的PEDV 主要引起哺乳仔豬發病，以2～7 日齡仔豬發病率最高，發病最嚴重。10 日齡內仔豬感染后出現腹瀉，首先表現為嚴重的水樣腹瀉，并伴發嘔吐、精神沉郁，在發病仔豬躺臥的地方會出現大量黃色惡臭的水樣便；2～4 日后大量死亡，死亡率一般為50%～100%。2013 年PEDV 導致華南地區超過100 萬頭仔豬死亡，發病豬場生產率受到嚴重影響，嚴重破壞了我國生豬養殖業的健康發展，但對妊娠母豬和其他生長階段豬群致病力不高，臨床癥狀較輕[14，24～25]。2015—2019年對河南發病豬場采集的575 份樣品檢測發現，哺乳仔豬PEDV 陽性檢出率達到60.47%，而育肥豬和母豬相對低，分別為43.28%和29.37%[21]。2010 年以后發生的PED 季節流行特征不明顯，被PEDV 污染的豬場全年都可發生仔豬腹瀉，但在秋冬季節或冬春季節變換期間，由于氣溫變化顯著，發病率相對更高。例如，春季和冬季采集樣品的PEDV 陽性檢出率較高，分別為54.10%和66.87%，而夏季和秋季相對較低，分別為23.40%和40.43%[21]。研究[26]還發現，PEDV 引起豬腹瀉的同時，常伴隨著其他腸道病毒感染。2015—2018 年從全國22 個省份采集543 份腹瀉樣品進行檢測發現，PEDV 陽性檢出率為66.85%，與其伴發感染的有13 種腸道病毒[豬捷申病毒（PTV）、TGEV、豬薩佩洛病毒（PSV）、豬腸病毒（PEV）、哺乳動物呼腸病毒（MRV）、豬A 組輪狀病毒（GARV）、豬星狀病毒（PAstV）、豬環曲病毒（PToV）、豬托克特諾病毒2 型（TTSuV-2）、豬博卡病毒（PBoV）、豬嵴病毒（PKV）和豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）]，陽性檢出率最低為3.58%（PSV），最高為81.55%（PKV）。不過在部分地區，PEDV 與常見豬腹瀉病毒混合感染的程度較低。2017—2018 年，從云南省39 個豬場采集184 份腹瀉樣品進行檢測發現，PEDV+TGEV 共感染率為1.09%（2/184），PEDV+PoRV 共感染率為3.26%（6/184），沒有發現PEDV+TGEV+PoRV三重感染[19]。

3 PEDV 流行毒株基因分型

3.1 基因分型依據

為了更好地區分不同毒株，依據毒株出現的時間不同，將PEDV 籠統地分為經典毒株和新變異毒株[27]。經典毒株是20 世紀70 年代出現的毒株，而新變異毒株是指2010 年以后全球流行的毒株。根據PEDV 的S基因或其N 端高變區S1區序列的同源性，將PEDV 分為2 個基因型——G1 型和G2 型，其中G1 型又分為G1a 和G1b 亞型，G2型又分為G2a 和G2b 亞型。2014 年1 月，美國研究人員從1 份疑似PEDV 感染樣品中分離到1 株PEDV，將其命名為OH851，樣品來源于感染母豬，但其哺乳的仔豬癥狀較輕，甚至無臨床腹瀉癥狀，也不死亡。與美國流行株（G2a）S基因序列比較發現，OH851 毒株的S基因有3 個缺失位點（167位缺失1 個堿基，176 位缺失11 個堿基，416 位缺失3 個堿基）和1 個插入位點（474～475 位有6 個堿基插入），同時，在S基因S1區的N 端1 170 bp片段上還有幾處核苷酸突變[28]。OH851 變異株S基因的堿基缺失、插入和突變很有可能是導致仔豬臨床癥狀減輕的原因[29]。該類新出現的毒株被命名為“S INDEL”毒株，其特點是對哺乳仔豬致病力低，致死率低，構成了G1b 亞型（圖1）[30]；而與之相對的新出現毒株被命名為“non-S INDEL”毒株?！皀on-S INDEL”毒株是指強毒力毒株，是引起目前全球PED 大流行的毒株，由G2a 和G2b亞型構成（圖1）[30]。通常把以CV777 毒株為代表的經典毒株歸為G1a 亞型。G1b（S INEDL）、G2a 和G2b 亞型都屬于2010 年以后新出現的毒株，其中G1b 為低致病力變異毒株，G2a 和G2b 屬于高致病力變異毒株，而G2b 為高致病力重組變異毒株。可以預見，隨著PEDV 的流行和疫苗免疫壓力的加大，PEDV 分子演化會一直持續，可能會不斷出現新的分支、亞型或基因型。

3.2 流行株基因分型

2010 年前，亞洲多地發生PEDV 流行，但多呈散發狀態[31]。對當時在亞洲流行的PEDV 毒株進行基因分型和來源地進化分析發現，這些毒株包括我國的4 個經典毒株（GenBank IDs：KC109141、JN547228、EF185992 和JX560761），1 個日本經典毒株（GenBank ID：KT968509）和3個韓國毒株（GenBank IDs：JQ023161、GU937797和KF898124）都屬于G1a 亞型。2010 年末我國華南地區暴發新型高致病性PED 后，各地有關新出現PEDV 的分子特征和遺傳演化關系的文獻被大量發表。2012—2017 年從我國15 個省400 個豬場采集的豬腹瀉樣品中獲得了1 235 條PEDV 的S1基因序列，通過遺傳演化分析發現，這1 235 株PEDV 分別屬于G1a、G1b、G2a 和G2b 亞型，占比分別為1.9%、9.6%、32.2%和56.3%；與經典毒株CV777（GenBank ID：AF353511）比較發現，G1a、G1b、G2a 和G2b 亞型毒株的同源性分別為88.1%～95.49%、92.52%～95.39%、75.00%～89.25%和79.39%～89.44%。我國目前流行的PEDV 主要是G2a 和G2b 亞型毒株[32]。另一項調查[26]顯示：2016—2018 年從全國22 個省份采集樣品中獲得的147 條PEDV 的S1序列，與130 條參考序列比較發現，29.25%屬于G2a亞型，70.75%屬于G2b亞型，沒有發現G1 基因型毒株；進一步分析發現，包括參考毒株在內的中國分離株中，64.79%的2011—2015 年流行毒株、50.62%的2016 年流行毒株、8.86%的2017—2018 年流行毒株屬于G2a 亞型，19.72%的2011—2015 流行毒株、49.38%的2016年流行毒株和91.13%的2017—2018 流行毒株屬于G2b 亞型。結果表明，從2010 年我國發生大面積高致病性PED 以來，流行的PEDV 屬于G2a 亞型的比率逐年減少，而屬于G2b 亞型的比率逐年增加（圖2）。

在其他區域性研究[20]中，2014—2018 年從我國川貴地區15 個城市的代表性豬場獲得了52條PEDV 的S全長基因，經遺傳進化分析發現，13.73%的毒株屬于“G1c”，1.96%屬于“G2a”，23.53% 屬于“G2b”，60.78% 屬于“G2c”，沒有發現G1a 毒株。需要說明的是，該研究中定義的“G2a”和“G2b”其實與通用G2a 屬于同一分支，“G2c”即為通用的G2b，“G1c”即為通用的G1b。這些結果表明，我國西南地區PEDV 遺傳背景復雜，有多個基因亞型毒株同時流行。這可能是我國頻繁的生豬跨省長途調運，增加了PEDV 的流行風險和復雜性。2015—2019 年，從河南省采集的豬腹瀉樣品中擴增出22 條PEDV 的S基因序列，經遺傳演化分析發現，16 株屬于G2a 亞型（高致病性變異毒株），6 株（2017—2018 年）屬于G1b亞型（低致病性S-INDEL），說明河南省流行的主要是高致病性G2a 亞型毒株；同時，2017 年以后出現低致病性G1b 亞型毒株，表明河南省流行的PEDV 毒株有不同的進化來源[21]。2017—2018年，在湖南、湖北、廣西等8 個省份39 個豬場采集的184 份腹瀉樣品中，擴增出有代表性的14 株PEDV 毒株S1基因，經基因遺傳演化分析發現，11 株屬于G2a 亞型，并且與2011 年在湖北省分離的高致病強毒株AJ1102（JX188454.1）親緣關系近，3 株屬于G2b，與2012 年在安徽省分離的高致病毒株AH2012（KC210145.1）和美國2013 年分離的高致病毒株USA/Colorado/2013（KF272920.1）親緣關系近[22]。

以上研究結果表明，2010 年以后在我國流行的PEDV 主要是高致病力毒株，分別屬于G2a（變異強毒株）和G2b 亞型（重組強毒株），與經典毒株G1a 亞型包括CV777 弱毒株和強毒株親緣關系遠，與G1b 亞型（S-INDEL 類毒株）親緣關系也較遠。同時也看到，S-INDEL 毒株在我國流行比較復雜。一段時間認為2015 年分離的ZL29 是唯一一株S-INDEL 毒株，但后來發現2004 年分離的JS-2004-2、CH5 毒株和2012 年分離的CH/SDZB/2012 毒株也屬于S-INDEL 毒株。這提示，早在2004 年我國可能就有S-INDEL 毒株流行，只是在2013 年前一直處于個別地區散發狀態，低于G2 基因型毒株的流行范圍，但2013 年以后，該亞型毒株開始在西南和華南地區流行[20]。這些信息表明，我國流行的PEDV 基因型復雜，有多種基因型同時流行。

4 PEDV 流行株變異

PEDV 全基因組序列分析表明，PEDV 變異株存在4 個高變區：V1—V4。V1主要包括nsp2基因的C 端和nsp3的N 端；V2位于S基因的S1區，參與病毒受體結合，該區域的改變可以導致PEDV跨物種或跨器官傳播；V3包括S基因的C 端和ORF3；V4存在于N基因中，與以往認為的N基因高度保守的觀點不一致[33]。PEDV 的S基因，特別是在S1區最容易發生變異。與經典毒株CV777比較，新出現的PEDV 變異株S1區（1～2 217 nt）存在3 個插入部位（162、170～180 和413～415 位）和1 個缺失部位（470～475 位），S1區也有3 個重要的抗原決定簇發生突變（248～280、442～499 和697～742 aa），這3 個抗原決定簇的改變可能是導致新出現PEDV 變異株毒力增強和經典疫苗株免疫保護失敗的主要原因[31，34]。

對2016—2018 年的147 份樣品擴增PEDV 的S1序列，經測序和同源性比較發現，147 個S1序列的核酸同源性為95.5%～99.9%，氨基酸同源性為94.2%～99.7%，而 與CV777（GenBank IDs：AF353511）比較，核苷酸同源性為90.7%～91.8%，氨基酸同源性為89.3%～90.7%。為進一步研究S1蛋白的遺傳進化特點，從NCBI 上下載53 條S1序列（2011—2014 年24 條、2015 年29 條），并將推導出S1 蛋白氨基酸序列作為參考序列；將53 條參考序列與147 條獲得的S1 蛋白氨基酸序列（2016年72 條、2017 年46 條、2018 年29 條）進行比較發現，2015—2018 年PEDV 的S1 蛋白平均氨基酸突變數分別是13.0、17.11、18.87 和16.17。S1 蛋白的V13A、L17F、G68Y、G70R、N139D、Y182H、M214T、P229L、T235I、I287M、H301Q、S334A、I503T、S524A、K570N、G616V和P638S 的氨基酸突變概率從2015 年到2018 年持續增加；2017 年PEDV 毒株S1 蛋白的L14I、A193S、R195N、D223G、T379I、G432S、E640V、F674V、D683A、P770L 和T781M 發生了突 變，2018 年V77A、H110Y、A112S、I154T、S246L、D304G、A331V、Y610H、A612D 和K637T 發生了突變[26]。

2017—2018 年，從我國湖南、湖北、廣西等8 個省份39 個豬場采集的184 份腹瀉樣品中，擴增出有代表性的14 株PEDV 毒株S1基因，發現其中1 株（HN-SY-2017-Oct）有9 個核苷酸插入T1152GAA GCC AAT1160T，編碼3 個氨基酸381KPI383，還有1 株（ZJ-2018-May）有3 個核苷酸缺失1126AAA1127，編碼1 個氨基酸372K。14 株S1基因的核苷酸同源性為97.2%～100%，氨基酸同源性為95.8%～100%；與CV777 弱毒株S1（GenBank ID：KT323979.1）序列比較，核苷酸和氨基酸同源性分別為90.7%～91.6% 和89.1%～90.0%，而與CV777 強毒株（GenBank ID：AF353511）S1序列比較，核苷酸和推導氨基酸的同源性分別為90.7%～91.6%和88.5%～89.1%；與我國高致病性強毒株AJ1102（JX188454.1）的S1基因核苷酸和推導氨基酸同源性分別為97.3%～98.7%和97.2%～98.2%，與美國高致病性強毒株USA/Colorado/2013（KF272920.1）的核苷酸和氨基酸同源性分別為97.9%～99.5%和97.2%～99.2%；而與致病力弱的S-INDEL OH851 株同源性較低，分別為91.9%～92.9%和90.7%～92.5%[22]。這也許能部分解釋經典CV777 疫苗株預防PEDV 流行強毒株失敗的原因。

研究[21]發現，我國流行的PEDV 毒株中存在S基因重組，從而出現新的重組毒株。為了確定PEDV 流行株S基因是否存在重組位點，采用RIP 軟件分析高致病力變異株CH-HNAY-2017（G2a）、CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）與參考毒株包括經典毒株（G1a 亞型CV777 和DR13）、S INDEL 毒株（G1b 亞型KNU-1406-1和OH851）、重組毒株（CH-HNYF14）和高致病力變異毒株（G2a 亞型CH-ZMDZY-11 和USA-Colorado-2013）。結果顯示：分離株CHHNAY-2017（G2a）、CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）的S基因上存在重組位點；CHHNAY-2017（G2a）的S基因與參考毒株CHZMDZY-11 和USA-Colorado-2013 有更高的相似性，CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）S基因與參考變異株CH-ZMDZY-11、USA-Colorado-2013有更高的相似性。用Simplot 軟件分析發現，CHHNAY-2017 和CH-HNZMD-2017 的S基因上都有幾處潛在重組位點。這些結果表明，除了堿基的插入、缺失導致PEDV 毒株變異外，不同毒株S基因的重組也是PEDV 遺傳進化的重要方式。

5 挑戰及展望

PEDV 是目前危害我國養豬業最重要的病原之一，幾乎在所有省份都有流行，并且通過基因的插入、缺失和重組等方式不斷發生演化和變異。高致病力毒株、變異毒株不斷出現，各類毒株之間的抗原性存在明顯差異，導致臨床上被感染仔豬發生腹瀉的情況更加復雜。臨床實踐和研究表明，用經典毒株制備的疫苗預防新出現的變異毒株，免疫效果并不理想。已有試驗證明，在細胞水平，用經典毒株誘發的抗體不能有效中和新出現的變異毒株。這些都表明，隨著PEDV 的不斷演化，用當前流行毒株研制新疫苗是預防PEDV 流行的持續性迫切需求。對于PEDV 的傳播，除了經典的“糞-口”途徑和最近確定的通過氣溶膠經呼吸道感染途徑外[35]，是否還有其他傳播途徑，是否可以通過乳汁經消化道感染和經胎盤垂直傳播，這些都需要進行不斷研究，以指導臨床防制實踐。同時，PEDV疫苗的免疫機制還不十分明確，血清中和抗體以及細胞免疫在疫苗免疫中的作用如何？是否只有乳汁分泌型IgA 在發揮免疫作用？以上這些問題都為有效防制PED 提出了新的挑戰，同時也為今后開展PEDV 研究指明了方向。持續開展PEDV 分子演化分析以及疫苗免疫機理、新疫苗研究將有助于預防和控制PED 在我國的流行。