對蝦急性肝胰腺壞死病病原菌RAA 檢測方法的建立

陳平亞，吳山楠，何翠華，張亮亮，吳少榮，王綏家，吳毓浪

（海口海關技術中心，海南海口 570311）

對蝦急性肝胰腺壞死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）是由攜帶毒力質粒弧菌導致的水產病害，2010 年首次發現于我國和越南境內，隨后相繼出現于馬來西亞、泰國、墨西哥和菲律賓等國，曾在我國南方地區的對蝦養殖場大面積暴發[1]。斑節對蝦（Penaeus monodon）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）均可患病。通常在放苗后7～35 d 內大規模發病，死亡率高達100%。患病對蝦肝胰腺萎縮且表面出現黑色斑點和條紋，甲殼變軟，尾扇及附肢變為淡藍色，空腸、空胃或腸道內食物不連續，在肝胰腺、腮、腸道、肌肉等組織中均能檢測到病原[2]。

AHPND 最初由副溶血弧菌的特定毒力株（VpAHPND）引起。與普通的副溶血弧菌基因相比，該類菌株攜帶了數個69 kb 的毒力編碼質粒pVA1。該質粒攜帶的致病基因能編碼PirA、PirB毒素蛋白，而PirB 毒素決定菌株致病力，PirA 相對較弱[3]。有研究[4]將含pirA和pirB基因的pVA1質粒轉化到非致病的弧菌中，證實該弧菌也能夠引起AHPND，而自然缺失pirA和pirB基因的VpAHPND突變菌株不能導致對蝦患病。敲除Pir 毒素基因后，致病菌失去致病力，而基因回補后，可再次獲得致病力[5]，因此推斷Pir 毒素是AHPND 的主要致病因子。根據目前的報道[6]，弧菌屬中的歐文氏弧菌（V.owensii）、哈維氏弧菌（V.harveyi）和坎貝氏弧菌（V.cambellii）均可攜帶pVA1 質粒，并引起對蝦患AHPND。因此，根據pVA1 質粒中pirB基因設計探針和引物，對VpAHPND進行檢測具有特異性。

重組酶介導等溫擴增（recombinase acid amplification，RAA）是利用重組酶以及DNA 聚合酶、單鏈結合蛋白（SSB）進行恒溫核酸擴增的技術，不需要熱循環過程。首先引物與重組酶結合形成復合體，在SSB 的參與下，在與引物同源的序列處使雙鏈DNA 解旋，SSB 防止單鏈DNA 復性，模板DNA 解鏈并使引物與模板配對，然后在DNA聚合酶的作用下，完成鏈的延伸，整個反應可在35 min 內完成。重組酶在常溫下就能打開DNA 雙鏈，若在熒光RAA 反應體系中加入熒光探針，即可實現熒光信號的實時監測，使檢測結果可視化。此外，RAA 技術還能夠完成多重實時擴增，在同一個反應體系里檢測多個目的基因[7]。

本研究針對pVA1 質粒pirB基因設計特異性引物和探針，建立了快速、靈敏的熒光RAA 檢測方法，并應用于對蝦組織器官樣本中AHPND 病原菌檢測，以期為AHPND 病原菌的快速檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株包括VpAHPNDHK190423 株、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、大腸埃希氏菌（Escherichia colt）、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）、傷寒沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）、創傷弧菌（Vibrio vulnificus），由海口海關技術中心動物實驗室分離保存。

1.1.2 對蝦樣品 從海口市、文昌市及周邊對蝦養殖場采集樣品，包括42 份凡納濱對蝦、36 份斑節對蝦和48 份中國明對蝦。

1.1.3 主要試劑 引物及探針，由上海生工公司合成；熒光型核酸擴增試劑（RAA 法），購自杭州眾測生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 ZB-32-1 實時熒光恒溫檢測儀，購自南寧壯博生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1pirB基因特異性引物、探針設計 從GenBank 上獲得pirB基因序列，應用Primer 6.0 軟件設計引物和探針。引物 pirB F：5'-CGAGCATTACCAATCTATTGAGT-3'；pirB R：5'-ACAACAAATGTTCGATCATCTG-3'。探針：5'-CGCTTACATTAAATATGTTGATGTTATTGCCAA（FAM-dT）GG（THF）CC（BHQ1-dT）GAAGCAATTGATCG-3'（其中FAM 為熒光報告基團，THF 為四氫呋喃殘基，BHQ1 為熒光淬滅基團，序列3'端加上C3 spacer 修飾）。引物和探針，由上海生工公司合成。

1.2.2 熒光PCR 擴增 PCR 擴增使用水產行業標準《急性肝胰腺壞死病診斷規程》（SC/T 7233—2020）推薦引物和方法。引物F：5'-TTGGACTGTCGAACCAAACG-3'；R：5'-CGACCCCATTGGTATTGAATG-3'。TaqMan探針：5'-FAM-AGACAGCAAACATACACCTATCATCCCGGATAMRA-3'。熒光PCR 反應體系（25.0 μL）：Probe qPCR Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL，探針（10 μmol/L）0.25 μL，模板（100 ng/μL）1.0 μL，用滅菌水補足至25.0 μL。反應程序：95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s、60℃30 s，45 個循環，每個循環結束后收集熒光信號。

1.2.3pirB基因質粒載體構建 采用 Primer 6.0引物設計軟件，設計帶酶切位點的特異性引物。F：5'-CGGGATCCATGACTAACGAATACGTTGTAAC-3'（劃線部分為BamHI 酶切位點）；R：5'-CCGCTCGAGCTACTTTTCTGTACCAAATTCATCG-3'（劃線部分為XhoI 酶切位點）。以VpAHPNDHK190423 株DNA 為模板進行PCR 擴增。反應體系（25.0 μL）：2×PremixTaq12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃30 s，72 ℃15 s，40 個循環；72 ℃ 3 min。將含有目的基因的PCR 擴增產物和pMD18-T 質粒載體，同時用限制性內切酶XhoI 和BamHI 酶切，再用T4 連接酶連接到pMD18-T 質粒載體中連接成重組質粒，然后將其轉化到大腸桿菌感受態DH5α 中，涂在含氨芐青霉素鈉的LB 瓊脂平板上，37 ℃倒置培養24 h 后挑單菌落接種到LB 液體培養基中，置搖床震蕩培養16 h，經質粒提取試劑盒回收、純化后測序。將測序結果正確的重組質粒作為陽性對照。按照重組質粒拷貝濃度計算公式，拷貝濃度（copies/μL）=質粒質量濃度（g/μL）×6.02×1023/質粒相對分子質量，質粒相對分子質量=堿基對的平均相對分子質量（660）×重組質粒總堿基對數（3 864），測得拷貝濃度為8.2×107copies/μL。將其進行10 倍梯度稀釋，即8.2×（107～101）copies/μL，以此為模板分別進行RAA 擴增和PCR 擴增，檢測熒光信號。

1.2.4pirB基因實時熒光RAA 反應條件 以8.2×107copies/μL 克隆質粒為模板，參照商品化熒光RAA 試劑盒說明書，建立VpAHPND的RAA檢測體系。反應體系為50.0 μL：加入A 緩沖液（PEG35000 水溶液）40.9 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，探 針（10 μmol/L）0.6 μL，B 緩沖液（乙酸鎂水溶液）2.5 μL，DNA 模板2.0 μL。配置好反應體系后，蓋上管蓋，充分混勻，低速離心后迅速將反應管放置于恒溫擴增儀中反應。

1.2.5 熒光RAA 靈敏度、特異性、重復性試驗對已知拷貝濃度的PMD18-pirB 重組質粒載體進行10 倍梯度稀釋，以各梯度濃度質粒為模板進行熒光RAA 方法檢測，確定該方法對pirB基因的最低檢出限；以VpAHPND-HK190423 株、糞腸球菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、福氏志賀氏菌、阪崎腸桿菌、溶藻弧菌、傷寒沙門氏菌、創傷弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌等作為對照菌株，用去離子水作為空白對照，采用SC/T 7233—2020 推薦的熒光探針PCR 檢測法作為平行對照，驗證熒光RAA 法檢測pirB基因的特異性；取8.2×103copies/μL 濃度的pMD18-T-pirB 重組質粒進行熒光RAA 試驗，設計8 次組內重復，測Ct 值并計算其平均值和標準差（S）及其變異系數（CV），以變異系數（標準偏差/重復值的平均數）評估該方法的重復性。

1.3 模擬樣品熒光RAA 檢測方法的應用

對蝦感染試驗采用浸泡感染，空白對照組使用滅菌海水浸泡對蝦樣品。將菌株VpAHPNDHK190423 株接種至胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）培養基中 100 r/min、28 ℃搖菌培養12 h；將培養好的菌液5 000 r/min 離心5 min，收集沉淀，用滅菌海水重懸。取42 份凡納濱對蝦、36 份斑節對蝦和48 份中國明對蝦樣品，采用菌株VpAHPNDHK190423 株菌懸液進行浸泡感染，浸泡感染24 h后換滅菌海水養殖。對瀕死對蝦肝胰腺組織進行取樣，每種對蝦分別取0.5 g 肝胰腺組織于1.5 mL 離心管中，加入0.5 mL 滅菌生理鹽水研磨勻漿，提取總DNA 作為模板。用建立的熒光RAA 檢測方法和SC/T 7233—2020 推薦的熒光探針PCR 法同時進行檢測，并對檢測結果進行比較。

2 結果

2.1 克隆載體構建

以提取的VpAHPND菌株DNA 為模板，將經PCR擴增獲得的目的基因片段用瓊脂糖凝膠電泳，獲得pirB基因條帶；回收純化目的基因片段和pMD18-T 質粒載體后，用T4 連接酶連接后轉化到感受態細胞DH5α 中，涂板培養24 h；挑選陽性菌落搖瓶培養，收集菌體后，提取重組質粒pMD18-T-pirB，同時用限制性內切酶BamHI 和XohI 進行酶切后電泳，結果出現1 條約1 200 bp 的目的片段和1 條約2 700 bp 的克隆載體片段，說明陽性質粒構建成功。

2.2 熒光RAA 靈敏度

用去離子水將拷貝濃度為8.2×107copies/μL的pMD18-T-pirB 質粒作10 倍系列稀釋，用稀釋后的模板進行熒光RAA 檢測，以確定該方法最低檢出限。結果（圖1）顯示，在8.2×101copies/μL質粒濃度時，仍出現擴增曲線，表明該檢測方法至少能檢測到8.2×101copies/μL，達到了SC/T 7233—2020 推薦的熒光PCR 法檢測靈敏度。

2.3 熒光RAA 特異性

用建立的熒光RAA 檢測方法對VpAHPNDHK190423 株、單核細胞增生李斯特菌等病原菌進行檢測，結果只有VpAHPND-HK190423 株出現了擴增曲線，而單核細胞增生李斯特菌等其他對照菌株和空白對照沒有出現擴增曲線（圖2），說明熒光RAA 法對VpAHPND的檢測具有特異性，檢測結果與SC/T 7233—2020 推薦的熒光PCR 法檢測結果一致。

2.4 熒光RAA 重復性

對樣品進行重復性試驗，選取8.2×103copies/μL濃度的pMD18-T-pirB 克隆質粒進行8 次重復的熒光RAA 試驗及熒光PCR 檢測。結果（圖3）顯示：熒光RAA 試驗變異系數是0.41%，表明重復性良好，穩定性強；而SC/T 7233—2020 推薦的熒光PCR 法變異系數是0.51%，重復性略低于熒光RAA 方法。

2.5 人工感染樣品檢測

應用建立的熒光RAA 方法對采集到的3 種對蝦樣品進行菌懸液浸泡感染后做熒光RAA 檢測，共檢出陽性樣本35 份，且陽性樣本對蝦具有AHPND 臨床癥狀和組織病理學特征。將熒光RAA 擴增結果為陽性的對蝦肝胰腺組織加入到含3%氯化鈉的堿性蛋白胨水液體培養基中，37 ℃增菌培養6 h，按照GB 4789.7—2013 方法進行劃線分離及生化鑒定，確定檢出的陽性樣品感染了VpAHPND。SC/T 7233—2020 推薦的熒光PCR 方法與熒光RAA 方法檢測3 種對蝦的檢測結果符合率為100%，說明該方法檢測對蝦臨床樣本具有很高可靠性。

3 討論

近年來，研究證明非副溶血弧菌也可以引起對蝦患AHPND。2015 年Kondo 等[8]分離出可致病的攜帶pVA1 質粒的歐文氏弧菌，并證實這株歐文氏弧菌能導致養殖對蝦患AHPND；2017年，Dong 等[9]從發病對蝦中分離到1 株可表達毒力蛋白PirAB 的坎貝氏弧菌，其能夠導致對蝦患AHPND；2018 年，Restrepo 等[10]分離出可引起AHPND 的浦那弧菌，該菌也攜帶有pVA1 質粒。pVA1 致病質粒可以在種間通過接合平行傳播，也可在垂直方向穩定遺傳給子代細胞，并可在子代中永久遺傳[11]。AHPND 致病菌可以是攜帶pVA1 質粒的副溶血弧菌，也有可能是攜帶pVA1 質粒的坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、浦那弧菌等病原菌，因此應該用建立的RAA 檢測方法對攜帶pVA1 質粒的坎貝氏弧菌、歐文氏弧菌、浦那弧菌也進行檢測驗證，但因缺少這幾種試驗菌株，未進行相關試驗，待以后補充。

試驗過程中，取病蝦肝胰腺組織在含3%氯化鈉的堿性蛋白胨水液體培養基中增菌，再提取DNA 進行熒光RAA 擴增結果呈弱陽性，而直接取病蝦肝胰腺組織提取DNA 進行熒光RAA 擴增結果曲線正常。這可能是因為增菌過程中肝胰腺組織中的VpAHPND在傳代中PVA1 質粒丟失所致。

目前已有多種核酸檢測方法應用于AHPND檢測，例如PCR 擴增方法及環介導等溫擴增技術（LAMP）。常規PCR、熒光定量PCR 和巢式PCR 擴增等方法對儀器和環境要求較高，且檢測時間較長，難以在基層推廣應用。LAMP 作為一種核酸等溫擴增技術，其反應靈敏度高于PCR 檢測方法，且熒光染料法可以直接通過肉眼觀察反應結果，但LAMP 反應產物是一些序列長度不等的片段，不能進行測序驗證，只能用于判斷是否有擴增條帶[12]。當然，RAA 檢測方法也存在不足之處，其擴增體系中存在大量蛋白酶，應用電泳分析結果前須純化去除蛋白質[13]。熒光RAA 方法與LAMP法相比所需時間更短，無需昂貴的PCR 儀器，只需要一臺能收集熒光信號的恒溫裝置，且靈敏度與熒光PCR 相當，同時還能完成多重擴增[14]，可使用恒溫熒光檢測系統，也可結合測流試紙條法檢測，具有廣闊的應用前景。

綜上，本試驗根據質粒pVA1 中pirB基因序列設計探針和引物，建立的對蝦AHPND 病原菌熒光RAA 擴增檢測方法，靈敏度高、特異性強、重復性好、操作步驟簡單，可用于水產養殖中對蝦樣品AHPND 的檢測。