禽蛋中甲硝唑殘留的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法建立

李 寧，肖 琎，苑中策，董潔瓊，王圓圓，鄭百芹，李 藝，霍路曼，張 誼，湯思凝，龐學(xué)良，葛 凱，李文杰，雷舒涵，李明陽(yáng)，張書(shū)宏，郝立武

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北唐山 063000；2.遵化市畜牧水產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，河北遵化 064200；3.唐山市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊(duì)，河北唐山 063000）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人民生活水平的日益提高，禽蛋作為人們從天然食物中攝取蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，其消費(fèi)比例及消費(fèi)量在不斷提高。據(jù)有關(guān)資料[1]顯示，2021年我國(guó)禽蛋產(chǎn)量為3 409萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的40%左右。隨著蛋禽養(yǎng)殖集約化、規(guī)模化的不斷推進(jìn)，疫病防控壓力也不斷增大。為了提高生產(chǎn)性能，獸用抗生素在蛋禽養(yǎng)殖過(guò)程中被廣泛使用，但若不嚴(yán)格遵守獸用抗生素的休藥期規(guī)定，很容易在禽蛋中造成獸藥殘留[2]。近年來(lái)，人們的食品安全意識(shí)不斷提高，在飼料端“禁抗”，養(yǎng)殖端“減抗、限抗”的大形勢(shì)下，禽蛋產(chǎn)品中的獸藥抗生素殘留問(wèn)題成為全社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)[3-5]。

甲硝唑（metronidazole，MNZ），又名滅滴靈，全名為甲硝羥乙唑，屬于硝基咪唑類(lèi)藥物，性質(zhì)穩(wěn)定。甲硝唑是不帶電荷的小分子化合物，在無(wú)氧條件下，分子中的硝基還原成氨基，生成有活性的高細(xì)胞毒中間體，殺滅微生物。因此，甲硝唑具有抗厭氧菌的作用，對(duì)需氧菌或兼性厭氧菌則無(wú)效。甲硝唑易進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是腦部厭氧菌感染的首選防治藥物，不易形成耐藥菌株，與常用抗生素聯(lián)用無(wú)拮抗作用，可用于阿米巴原蟲(chóng)病和滴蟲(chóng)病防治，對(duì)治療雞生殖系統(tǒng)疾病及炎癥效果較好[6-7]。甲硝唑?qū)?xì)胞有致突變、致癌作用。2017 年，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究所將甲硝唑列為2B 類(lèi)致癌物[8]。我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）規(guī)定，甲硝唑允許作治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出[9-10]。

目前，供人們普遍食用的禽蛋主要有雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鵪鶉蛋等。禽蛋營(yíng)養(yǎng)豐富，易被人體吸收且價(jià)格實(shí)惠，深受大眾喜愛(ài)[11-12]。但目前禽蛋中甲硝唑的殘留檢測(cè)尚未有相應(yīng)的國(guó)標(biāo)方法，相關(guān)研究報(bào)道也較少[13]。已發(fā)表的文獻(xiàn)也多為雞蛋中甲硝唑殘留檢測(cè)方法，且存在前處理過(guò)程復(fù)雜，回收率不理想、不適合大批量禽蛋樣品檢測(cè)等問(wèn)題。本研究建立并優(yōu)化了禽蛋中甲硝唑藥物殘留的檢測(cè)方法，以期為滿(mǎn)足禽蛋中甲硝唑藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)需求提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑耗材

AB Sciex ExionLC 高效液相色譜儀、AB Sciex Triple Quad 5500+三重四極桿聯(lián)用質(zhì)譜儀，美國(guó)AB SCIEX 公司；PRiME HLB 6cc（200 mg）固相萃取柱，美國(guó)waters 公司；JJ200A 分析天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；KQ-800KDB 型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司；VORTEX 3 渦旋混勻儀，德國(guó)IKA 公司；LYNX4000 冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技有限公司；DN-12 水浴氮吹儀，杭州聚同電子有限公司；MFLN-30 氮?dú)獍l(fā)生器，北京中惠普分析技術(shù)研究所；CSR-1-1011 超純水機(jī)，北京愛(ài)思泰克科技開(kāi)發(fā)有限公司。

甲硝唑（100 μg/mL）、甲硝唑-D4 同位素內(nèi)標(biāo)（100 μg/mL）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，均購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司；色譜純甲醇、乙酸乙酯、乙腈、0.22 μm 尼龍濾膜，均購(gòu)自美國(guó)Dikma 公司；五氟苯基（Kinetex F5）色譜柱，購(gòu)自美國(guó)菲羅門(mén)Phenomenex 公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取甲硝唑、甲硝唑-D4 同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以甲醇為溶劑，配制成10 000 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存于-20 ℃冰箱；用甲醇-水（體積比1:1，下同）分別將甲硝唑、甲硝唑-D4 同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為100 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作液；準(zhǔn)確移取甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)工作液100 μL 至10 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1:1）定容至刻度，配制成1 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)工作液。

配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加入甲硝唑-D4 同位素內(nèi)標(biāo)（100 μg/L）標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL，上機(jī)檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品采集與前處理?xiàng)l件優(yōu)化

隨機(jī)采集唐山市周邊各縣（區(qū)）超市、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)禽蛋樣品。稱(chēng)取同批次禽蛋樣品5 g 于50 mL離心管中，分別用10 mL 乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙腈-水（9:1）、乙腈-水（4:1）、乙酸乙酯-甲醇（19:1）、乙酸乙酯-甲醇（9:1）、乙酸乙酯-甲醇（4:1）充分提取；渦旋5 min，超聲10 min，8 000 r/min 離心5 min，待凈化。

1.4 凈化

將4 mL 待凈化溶液直接加入PRiME HLB 固相萃取柱，保持1 滴/s 流速，用10 mL EP 管收集流出液；加入1 mL 乙腈，3 000 r/min 渦旋混勻30 s，再次全部倒入PRiME HLB 固相萃取柱，用吸耳球吹盡固相萃取柱中的殘余溶液；將收集的溶液45 ℃氮吹至1 mL 以?xún)?nèi)，用乙腈-水（1:9）定容至1 mL；渦旋混勻30 s，經(jīng)0.22 μm 尼龍濾膜過(guò)濾后備用。

1.5 色譜條件與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別試驗(yàn)以下流動(dòng)相組合：0.1%甲酸水-甲醇、純水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、純水-乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、純水-0.1%甲酸乙腈、純水-0.1%甲酸甲醇。通過(guò)比較不同的流動(dòng)相搭配，分別進(jìn)行等度洗脫和梯度洗脫，對(duì)甲硝唑及甲硝唑-D4 內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)度及峰形進(jìn)行選擇性?xún)?yōu)化。

AB Sciex Triple Quad 5500+三重四極桿聯(lián)質(zhì)譜儀在電噴霧離子源（ESI+）多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）下，調(diào)整質(zhì)譜條件參數(shù)，去簇電壓分別在40、50、60、70 v，碰撞電壓分別在15、20、22、25、30、35、37、40 v 等條件下進(jìn)行優(yōu)化選擇，確定最適去簇電壓和碰撞電壓。

1.6 添加回收試驗(yàn)

選擇超市或市場(chǎng)上常見(jiàn)的禽蛋（雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鵪鶉蛋）分別在定量限、2 倍定量限、10 倍定量限開(kāi)展加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn)，每個(gè)定量限進(jìn)行7 個(gè)水平測(cè)定，驗(yàn)證方法的回收率及重復(fù)性。

1.7 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用建立的方法對(duì)唐山地區(qū)市售的2 098 份禽蛋樣品進(jìn)行甲硝唑殘留檢測(cè)，并利用進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物源性食品中多種堿性藥物殘留量的檢測(cè)方法 液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法》（SN/T 2624—2010）進(jìn)行復(fù)檢，比較兩種方法的符合性。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1～50.0 μg/L 檢測(cè)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖1），線性方程為Y=0.158 84X-0.001 58（R=0.999 90，R2=0.999 81）；甲硝唑在禽蛋中的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.15 μg/kg 和0.50 μg/kg。

2.2 樣品制備及前處理優(yōu)化結(jié)果

將同批次的禽蛋樣品（不少于5 枚）破殼后，蛋黃與蛋清打入同一潔凈容器中，攪拌均勻；準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g 待測(cè)試樣于50 mL 離心管中，加入50 μL甲硝唑-D4 同位素內(nèi)標(biāo)（100 ng/mL）標(biāo)準(zhǔn)工作液，同時(shí)加入9.5 mL 乙酸乙酯和0.5 mL 甲醇，震蕩渦旋5 min，超聲提取10 min；4 ℃ 8 000 r/min 離心5 min，取5 mL 上清液至10 mL EP 管中，45 ℃氮吹至近干，加入4 mL 乙腈水（4:1）充分渦旋（1 500 r/min）30 s，待用。

2.3 色譜條件及質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化后的色譜條件為色譜柱：五氟苯基（Kinetex F5）色譜柱100A（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：3 μL；流速：0.35 mL/min；流動(dòng)相：水相為0.1%甲酸水，有機(jī)相為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫。HPLC 梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

優(yōu)化后的質(zhì)譜條件為電噴霧離子源（ESI+）模式；電噴霧電壓（IS）5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）：35 psi；碰撞氣（CAD）：Medium；輔助氣1（GS1）：50 psi；輔助氣2（GS2）：50 psi；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描（MRM）。甲硝唑定量離子和定性離子對(duì)、甲硝唑-D4 內(nèi)標(biāo)離子對(duì)信息見(jiàn)表2，0.50 μg/L 甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液及甲硝唑-D4 離子對(duì)圖譜見(jiàn)圖2。

表2 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)

2.4 添加回收試驗(yàn)

選擇市場(chǎng)上常見(jiàn)的禽蛋（雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鵪鶉蛋）分別在0.5、1.0、5.0 μg/kg 3 個(gè)定量限做添加回收試驗(yàn)。結(jié)果（表3）顯示，該方法的回收率為93.70%～106.83%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.66%～3.80%，雞蛋、鴨蛋、鵝蛋、鵪鶉蛋的批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.92%、3.48%、3.79%、2.45%，批間變異系數(shù)分別為2.84%、2.57%、3.09%、3.68%，說(shuō)明該方法重復(fù)性較好。雞蛋空白樣品和加標(biāo)定量限為1.0 μg/kg 樣品甲硝唑及甲硝唑-D4內(nèi)標(biāo)離子對(duì)圖譜見(jiàn)圖3、圖4。

表3 禽蛋樣品不同定量限的添加回收試驗(yàn)結(jié)果

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

應(yīng)用本研究建立的方法和SN/T 2624—2010中規(guī)定的方法對(duì)2 098 份禽蛋樣品進(jìn)行甲硝唑殘留平行檢測(cè)。結(jié)果顯示：2 種方法均檢出1 份甲硝唑殘留樣品，定性結(jié)果一致，定量結(jié)果分別為16.9 μg/kg 和15.6 μg/kg，結(jié)果相差8.3%，在允許偏差范圍內(nèi)。表明本研究建立的方法能夠滿(mǎn)足禽蛋產(chǎn)品中甲硝唑日常風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)需求。

3 討論

禽蛋樣品獸藥殘留分析方法中常選用的提取液有乙腈、乙酸乙酯、乙腈-水的不同配比等。禽蛋樣品呈液態(tài)，并富含蛋白質(zhì)、脂類(lèi)等物質(zhì)，殘留藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合，不利于解離，影響待測(cè)物的提取效率。乙酸乙酯作為一種高效的提取試劑，可提取雞蛋中殘留的甲硝唑，但由于乙酸乙酯不具有沉淀蛋白的作用，所以提取過(guò)程中的禽蛋蛋白質(zhì)難以沉淀。甲醇具有沉淀蛋白的作用，加入少量甲醇可沉淀蛋白質(zhì)。本研究經(jīng)過(guò)比較驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，以乙酸乙酯-甲醇（19:1）作為雞蛋中甲硝唑殘留提取液，效果較為理想。

PRiME HLB 固相萃取柱不需要提前活化，可節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，且具有吸附脂肪等雜質(zhì)的功能，凈化除脂效果較好。禽蛋樣品經(jīng)乙酸乙酯-甲醇提取、氮吹后，管底會(huì)殘留少量油狀物，若選用乙腈溶解殘留油狀物，油狀物中的脂肪等雜質(zhì)會(huì)完全溶于乙腈，并隨著乙腈通過(guò)PRiME HLB 固相萃取柱，凈化效果不理想；若選用乙腈-水（4:1）溶解殘留油狀物，會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，脂肪等雜質(zhì)沉在管底，雖然具有分離雜質(zhì)的作用，但甲硝唑回收效果不理想。為了提高甲硝唑回收率，本研究發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-水（4:1）先溶解油狀物，再用乙腈溶解管底殘留物，既提高了甲硝唑的回收率，又凈化了油狀物等雜質(zhì)。

本研究建立的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定禽蛋中甲硝唑殘留的方法，操作簡(jiǎn)便快捷，固相萃取柱無(wú)需提前活化，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間；凈化除脂效果良好，回收率更加穩(wěn)定；內(nèi)標(biāo)法定量，比外標(biāo)法定量結(jié)果更準(zhǔn)確。可用于大批量禽蛋樣品中甲硝唑殘留的檢測(cè)。