非洲豬瘟病毒基因分型與血清分群研究進(jìn)展

戈勝強(qiáng)，左媛媛，韓乃君，呂 艷，屈海龍，路皓東，吳曉東，王志亮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271018）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）基因組為線狀雙鏈DNA，整個(gè)基因組長度為170～193 kb，包括左側(cè)可變區(qū)（left variable regions，LVR）38～48 kb，中央保守區(qū)（central conserved region，C 區(qū)）約125 kb 和右側(cè)可變區(qū)（rightvariableregion，RVR）13～22 kb。不同毒株的基因組序列可能會在LVR 內(nèi)的多基因家族（mltigene family，MGF）、C 區(qū)內(nèi)的中央可變區(qū)（central variable region，CVR）和EP402R基因（表達(dá)CD2v 蛋白）等位置存在顯著差異。這些可變區(qū)為ASFV 的進(jìn)化分析特別是遺傳演變研究提供了有力條件。但是我國針對該領(lǐng)域還無專業(yè)闡述，沒有全面展示ASFV 基因分型和血清分群的研究進(jìn)展，為此就相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為我國ASFV診斷技術(shù)及遺傳演變研究提供參考。

1 基因分型研究

在非洲豬瘟（African swine fever，ASF）早期研究中，科研工作者借助紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)（hemadsorption reaction）[1-2]、瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)（agar diffusion precipitin test）[3]、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（complement-fixation test）[4]和等電沉淀技術(shù)（isoelectric precipitation）[5]等諸多技術(shù)，逐漸認(rèn)識到ASFV 存在抗原多樣性。隨后，利用限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析，將ASFV 分為I、II、III 和IV 共4 個(gè)主要群（1984 年）[6]或I—V共5 個(gè)組（1989 年）[7]，并提出以此方法進(jìn)行病毒分型應(yīng)以基因組的中間位置為目標(biāo)區(qū)域。另有報(bào)道[8]利用RFLP 對軟蜱中分離的ASFV 進(jìn)行了分型研究；但是RFLP 技術(shù)無法快速進(jìn)行病毒來源追溯，使得利用該技術(shù)進(jìn)行ASFV 分型的研究停滯不前[9]。伴隨著基因克隆技術(shù)、PCR 技術(shù)和測序技術(shù)的快速發(fā)展，ASFV 的基因組研究也在不斷深入。繼1984 年首次成功構(gòu)建含有98%基因組信息的文庫[10]之后，ASFV基因組文庫構(gòu)建的研究逐漸增多，這為后期的基因測序及分析打下了基礎(chǔ)。

1.1 P72（B646L）基因分型

1990 年，Lopez-Otin 等[11]對P72 蛋白編碼基因全長進(jìn)行了測序分析，為研究P72 蛋白編碼基因作為診斷基因奠定了基礎(chǔ)（P 為結(jié)構(gòu)蛋白英文縮寫，72 指蛋白相對分子質(zhì)量103的數(shù)字部分[12]）。1992 年，Steiger 等[13]首次利用PCR 技術(shù)建立了ASF 快速診斷技術(shù)。1996 年，Yu 等[14]對4 株分離自不同地區(qū)的ASFVP72基因核酸及編碼蛋白序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)P72基因序列高度一致（97.8%～100%），該結(jié)果與之前研究[15-16]發(fā)表的P72 蛋白抗原穩(wěn)定的結(jié)論相符，由此進(jìn)一步奠定了P72基因作為抗原分型理想基因的重要地位。

2001 年，Gonzague 等[17]利用P72基因部分片段證明了1999 年分離的ASFV 馬達(dá)加斯加毒株與1994 年分離的莫桑比克毒株序列最接近。2003年，Bastos 等[9]利用P72 蛋白C 端末端（位置為498～635）序列，首次將ASFV 劃分為10 個(gè)基因型。通過與RFLP 方法比較，該研究證實(shí)在P72基因序列水平上，不同ASFV 毒株之間的遺傳變異率可達(dá)9.4%，說明該方法適宜進(jìn)行分子流行病學(xué)分析且可以更好地區(qū)分暴發(fā)時(shí)間和地理分布相近的非洲東部或南部毒株。2005 年，Lubisi 等[18]進(jìn)一步將ASFV 劃分為16 個(gè)基因型，并首次從東非境內(nèi)的森林循環(huán)宿主（軟蜱或野豬）中發(fā)現(xiàn)基因I 型毒株。2007 年，Boshoff 等[19]對南非1973—1999 年分離的43 株ASFV 進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)新分支。至此，ASFV 被劃分為22 個(gè)基因型。

此后，ASFV 的進(jìn)化分析主要以此為基礎(chǔ)，利用P72基因進(jìn)行ASFV 基因分型的研究逐漸增多并成為最重要的分型標(biāo)準(zhǔn)。2016 年，Achenbach等[20]對2011—2014 年埃塞俄比亞分離的ASFV 進(jìn)行P72基因進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)了第23 個(gè)基因型。該基因型與流行于非洲東部國家和剛果民主共和國的IX 和X 基因型來源于同一個(gè)進(jìn)化分支。2017 年，Quembo 等[21]在莫桑比克戈龍戈薩國家森林公園采集的軟蜱樣品中分離到19 株ASFV，經(jīng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，其中5 株病毒屬于新的進(jìn)化分支，因此被命名為第24 個(gè)基因型。基于P72基因分型已被廣泛使用，所以通常所說的ASFV 基因型就是指P72基因分型。

1.2 IGR 分型

雖然P72基因分型的方法得到大多數(shù)研究者認(rèn)可，但這種分型對于家豬相關(guān)分支（如基因I 型分支，又稱ESACWA 分支）內(nèi)毒株相互之間的區(qū)分度太低，因此導(dǎo)致P72基因分型方法較少用于追蹤同一區(qū)域內(nèi)疫情暴發(fā)的源頭和過程[9，22]。為進(jìn)一步查找同一地域內(nèi)相近毒株的進(jìn)化演變趨勢，2014 年Gallardo 等[23]對ASFV 全基因序列進(jìn)行了深度分析，發(fā)現(xiàn)不同地域/時(shí)間流行的ASFV 在I73R和I329L基因的中間區(qū)域（intergenic region，IGR）存在不同數(shù)量組合的串聯(lián)重復(fù)序列（tandem repeat sequences，TRS），如波蘭和立陶宛ASFV分離株的IGR 與白俄羅斯和烏克蘭分離株相同（有10 bp 的重復(fù)序列插入，后命名為IGR-II 型），而與俄羅斯分離株不同（無10 bp 的重復(fù)序列插入，后命名為IGR-I 型），提示波蘭和立陶宛ASFV 流行株可能來自白俄羅斯。但進(jìn)一步研究[24]發(fā)現(xiàn)，俄羅斯境內(nèi)的ASFV 分離株從2012 年開始在IGR位置出現(xiàn)變化，提示傳入歐盟的ASFV 毒株可能來源于俄羅斯。該毒株于2012 年或更早的時(shí)期出現(xiàn)，經(jīng)由白俄羅斯和烏克蘭傳入歐盟。2015 年以后，在波蘭檢測到IGR-I 型毒株，在俄羅斯西部檢測到IGR-II 型毒株，表明歐洲地區(qū)的病毒流行更加復(fù)雜，也說明IGR 分型可以對ASFV 的分子流行情況提供更精確的分析，并在很多研究中成為與P72基因分型和CD2v 血清學(xué)分型同等重要的分析指標(biāo)，如在中國[25-27]、比利時(shí)[28]、印度[29]、韓國[30]、馬來西亞[31]、印度尼西亞[32]、越南[33]、俄羅斯[34]、意大利[35]等首發(fā)/重要疫情確診毒株或長時(shí)間流行毒株演變分析中，均使用IGR 分型進(jìn)行進(jìn)化溯源分析。

2018 年8 月，ASFV 傳入我國后，我國科學(xué)家對引發(fā)每次疫情的分離株都進(jìn)行IGR 分型分析。目前國內(nèi)主要的流行毒株屬于IGR-II 型。但2018 年11 月國內(nèi)分離的第一個(gè)野豬疫情毒株（China/Jilin/2018/boar，MK189457）屬 于IGR-I型，與當(dāng)時(shí)家豬流行毒株不同，因此推測此次疫情不是由周邊家豬傳入[27]。2019 年3 月，國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)IGR 位置出現(xiàn)2 個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列（20 bp）插入的毒株（China/Guangxi/2019/domestic pig，MK670729），這是世界范圍內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，并因此將其命名為IGR-III 型毒株[26]。相似的，IGR I—III 型毒株在韓國[36]和越南[37]也有報(bào)道。較詳細(xì)的數(shù)據(jù)顯示，越南對2019—2021 年分離的122 株ASFV 進(jìn)行了IGR 分型研究，發(fā)現(xiàn)IGR II 型毒株占95.9%（117/122），IGR III 型占3.3%（4/122），IGR I 型只分離到1 株[37]。2019 年，波蘭發(fā)現(xiàn)了3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列（30 bp）插入的毒株（Poland，Warminsko-Mazurskie 2019），并將其命名為IGRIV 型毒株[38]。IGR 分型的不斷增加，預(yù)示著ASFV 在長時(shí)間流行過程中，伴隨著在豬體內(nèi)的不斷復(fù)制傳播，可能會在某些位置（如IGR 位置）出現(xiàn)序列變化。

1.3 9RL/B602L 基因分型

1990 年，Dixon 等[39]利用RFLP 技術(shù)，對17 株馬拉維共和國分離株進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)在ASFV 基因組中部125 kb 的保守區(qū)域內(nèi)含有1 個(gè)CVR。1996 年，Irusta 等[40]進(jìn)一步對CVR 研究發(fā)現(xiàn)，該可變區(qū)是因9RL基因中四聚體重復(fù)區(qū)存在序列差異導(dǎo)致的，且在不同毒株以及細(xì)胞適應(yīng)株與種毒之間變異性較高。Irusta 等[40]發(fā)現(xiàn)CVR 的片段大小為228～300 bp，Phologane 等[22]發(fā)現(xiàn)CVR 片段大小為360～686 bp，而Boshoff 等[19]發(fā)現(xiàn)CVR 片段大小為377～533 bp。2020 年，Vilem 等[41]又進(jìn)一步將基因II 型分離株劃分為GII-CVR1 和GIICVR2。不同毒株之間CVR 序列信息和片段大小都有差別[22，42-43]，這種多變性使得CVR 不適合進(jìn)行基因型劃分[19，42]，但在探討國家[42]、地區(qū)[19]層面以及基因型間[43]流行復(fù)雜性上可以發(fā)揮作用[44]。目前利用B602L基因進(jìn)行ASFV 分析常與P72基因相結(jié)合，首先以P72基因進(jìn)行基因分型，然后利用CVR 進(jìn)行差異分析，以進(jìn)一步明確相同P72基因型內(nèi)各個(gè)毒株的關(guān)系。

1.4 P54（E183L）基因分型

雖然早在1995 年，Sun 等[45]就已證實(shí)P54基因在不同細(xì)胞傳代株之間可以發(fā)生變異，但基于P54基因進(jìn)行進(jìn)化樹分析的卻不是很多。2008 年，Rowlands 等[46]分析了2007 年傳入格魯吉亞的ASFV，發(fā)現(xiàn)其P54基因序列與5 株馬達(dá)加斯加分離株和2 株莫桑比克分離株完全一致，與之后分離的2 株莫桑比克分離株在多個(gè)位點(diǎn)有差異，此結(jié)果對研究格魯吉亞毒株的來源發(fā)揮了重要作用。2009年，Gallardo 等[47]同時(shí)利用P54、P72和B602L基因?qū)夏醽?006—2007 年流行的ASFV 分離株進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P54與P72的基因進(jìn)化樹基本一致，但在P72基因型最大分支基因I型中，P54基因型可進(jìn)一步劃分為4 個(gè)分支，分別被命名為Ia、Ib、Ic 和Id。Ia 型主要來自歐洲和美洲，Ib 型來自西非國家，包括Lisbon57 毒株，而Lisbon60 和Mzuki 毒株則分別被劃分為Ic 和Id 型。另有研究[48]對贊比亞2005 年分離株的P54基因進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株屬于P54基因型 Id 分支，提示引起此次疫情暴發(fā)的毒株可能來自贊比亞國內(nèi)或南非區(qū)域。但進(jìn)一步研究[49-50]顯示，贊比亞分離株的P54基因分型還曾包含有Ie、If、Ig、IIa、IIb、VIIIa、VIIIb、XI、XIII 和XIV，提示贊比亞流行株包含了多個(gè)進(jìn)化分支。目前，P54基因分型只作為輔助分析指標(biāo)使用，可能原因是P54基因分型相比P72基因分型，差異不顯著，且相比CVR 分析，區(qū)分度不顯著。

1.5 其他基因分型

除常利用P72基因、IGR 位置、9RL/B602L基因和P54基因進(jìn)行基因分型外，為更好地探討毒株之間的進(jìn)化差異，特別是同一個(gè)區(qū)域內(nèi)毒株的進(jìn)化趨勢，研究者還對P30（CP204L）[35，46，50]、CD2v（EP402R）[35]、TK（thymidine kinase）[51]以 及J268L[43]、Bt/Sj[43]、KP86R[43]、O174L[52]、C315R/C147L[53]、K145R[38]和MGF 505-5R等基因[38]進(jìn)行比對分析。Nix 等[43]對J268L、Bt/Sj和KP86R基因進(jìn)行序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同分離株的基因長度和序列有部分差異，可以用于區(qū)分進(jìn)化相近的分離株。Sanna 等[35]利用P30（CP204L）基因、IGR 位置和EP402R基因?qū)σ獯罄龆u流行多年的ASFV 進(jìn)行了基因分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P30基因和IGR 位置高度穩(wěn)定，而EP402R基因卻可以將毒株劃分為2 個(gè)分支——第一個(gè)分支為1978—1990 年流行毒株，第二個(gè)分支為1990—2014 年流行毒株，這提示ASFV 流行株可能在不斷提升的疫病控制和診斷技術(shù)水平下，受到選擇壓力的影響發(fā)生部分變異。2017 年，Onzere 等[51]首次利用TK基因?qū)SFV 流行株進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2011—2013 年的肯尼亞分離株與南非參考毒株有明顯差異。2019 年，Mazur-Panasiuk 等[54]通過全基因測序在波蘭分離株中發(fā)現(xiàn)K145R和MGF 505-5R等基因中出現(xiàn)單個(gè)核酸序列改變導(dǎo)致的蛋白序列改變（single nucleotide polymorphism，SNP）。隨后，通過對O174L基因、K145R基因和IGR 位置進(jìn)行同時(shí)測序和組合比對，將波蘭毒株分為4 個(gè)遺傳進(jìn)化群[38]。這些研究提示，將上述“分子指紋”（molecular fingerprints）基因進(jìn)行組合分析，可更深入地了解同一區(qū)域內(nèi)毒株的流行演變規(guī)律。

2 血清分群研究

1963 年，通過紅細(xì)胞吸附抑制（hemadsorption inhibition，HAI/HADI）試驗(yàn)和感染豬交叉保護(hù)試驗(yàn)，科學(xué)家首次用試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)ASFV 存在抗原差異[2]。隨后對多株ASFV 進(jìn)行的HAI 顯示，ASFV之間的抗原差異可將ASFV 進(jìn)行分類或分型[1，55]，并將具有血凝性的ASFV 分為A、B 和C 共3 個(gè)亞型[56]。但這種分型方式?jīng)]有繼續(xù)使用下去，可能原因是HAI 試驗(yàn)需要活病毒和恢復(fù)期血清，而ASFV 的高致死率無法持續(xù)獲得血清轉(zhuǎn)化的存活家豬[6]，且針對HAI 的抗體產(chǎn)生時(shí)間較晚，滴度較低[57]。因此，探索HAI 血清分群機(jī)理，查找HAI血清分群抗原決定簇顯得尤為必要。經(jīng)過眾多研究者的不斷努力[58-63]，最終證實(shí)CD2v（EP402R）和EP153R（C-type lectin）基因與ASFV 的HAI緊密相關(guān)，且該區(qū)域?yàn)锳SFV 基因組序列中變異較大的區(qū)間[64]。隨后，俄羅斯VNIIVViM 研究所進(jìn)行了更深入長久的研究，并最終基于CD2v 和C-type lectin 蛋白編碼基因的特定區(qū)域序列比對，將ASFV 劃分為至少8 個(gè)血清群[57]。經(jīng)與P72基因分型比較，Malogolovkin 等[65]發(fā)現(xiàn)：P72基因分型與基于CD2v 和C-type lectin 的血清分群在相對有限區(qū)域內(nèi)（如南非地區(qū)的分離株）差異較大；相反，在一些只有單一基因型疫情暴發(fā)的非疫源地國家，分離毒株的基因分型和血清分群無顯著差異；同時(shí)，同一個(gè)基因型內(nèi)也可能包括多個(gè)血清群，如血清I 型、II 型、IV 型都可被劃分到基因I 型中，說明歐洲大陸分離的ASFV 毒株有多種來源背景。以上結(jié)果進(jìn)一步說明，在某些情況下，標(biāo)準(zhǔn)的P72基因分型可能無法有效區(qū)分相似來源背景的ASFV毒株。

3 結(jié)語

ASFV 基因分型與血清分群都是基于特定的基因序列比對分析所得，目前通過常規(guī)PCR 擴(kuò)增和核苷酸測序比對分析可以很快確定ASFV 基因分型與血清分群。ASFV 基因組較大，所以ASFV 在不同細(xì)胞系、宿主體內(nèi)（特別是在野豬和軟蜱）復(fù)制傳代時(shí)，容易造成基因組末端可變區(qū)和中央可變區(qū)發(fā)生序列插入和缺失。而P72基因相對保守，所以當(dāng)只有一個(gè)毒株在一定區(qū)域內(nèi)流行時(shí)，一般不會發(fā)生基因型變化，因此P72基因分型是國際最通用、快速、方便的分型方法，并且仍是病毒新傳入某區(qū)域后進(jìn)行鑒別診斷的首選方法。其他基因分型及血清群分析，因這些基因變異性相對更強(qiáng)，故可有助于分析ASFV 分子流行病學(xué)變化和預(yù)判毒力演變。研究ASFV 基因分型可以有助于從分子水平追溯引發(fā)疫情的病毒來源，掌握潛在的傳播途徑及可能的傳播方式。

目前非洲流行的ASFV 包含所有的24 個(gè)基因型，且主要分布在東非和南非。中非主要流行基因I 型和II 型，西非部分國家主要流行基因I 型，而北非尚無疫情報(bào)道[66]。20 世紀(jì)60 年代在西歐國家流行的毒株主要是基因I 型，2007 年傳入格魯吉亞并擴(kuò)散到俄羅斯、東歐諸國的毒株是基因II 型、血清8 群。我國ASFV 流行株和亞洲流行株也是基因II 型、血清8 群。因此，研究ASFV 基因分型和血清分型有助于從分子水平追溯引發(fā)疫情的病毒來源，掌握潛在的傳播途徑及可能的傳播方式，對于該病的流行病學(xué)分析具有重要意義。