2021—2022 年我國部分地區市場交易鴿群腺病毒檢測及遺傳進化分析

邢安琪，于曉慧，彭真奇，3，克軍宏，4，李 陽，蔣文明，許立華，王靜靜，劉華雷

（1.寧夏大學，寧夏銀川 750021；2.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；3.安徽農業大學，安徽合肥 230036；4.塔里木大學，新疆阿拉爾 843300）

腺病毒（adenoviruses）屬于腺病毒科（Adenovirus），為無囊膜雙股線性DNA 病毒[1-2]，呈球形，外殼蛋白主要由六鄰體蛋白（hexon）、五鄰體蛋白（penton）和纖維蛋白（fiber）構成，其中hexon 蛋白含主要抗原決定簇，參與免疫反應，能誘導產生中和抗體，并且與病毒致病性密切相關[3-4]。國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將腺病毒科分為5 個屬，分別為哺乳動物腺病毒屬（Mastadenovirus）、禽腺病毒屬（Aviadenovirus）、胸腺病毒屬（Atadenovirus）、唾液腺病毒屬（Siadenovirus）和魚腺病毒屬（Ichtadenovirus）。腺病毒可以感染40 多種脊椎動物[1-2，5-6]，其中禽類是其常見宿主[4，7-10]。

禽腺病毒是鴿群中的一種常見病原體[11]。1984 年，Cousement 等[4]在比利時首次報道了鴿腺病毒（pigeon adenovirus，PiAdV）感染，隨后該病毒在世界范圍廣泛傳播。1995 年，De Herdt等[12]描述了I 型和II 型PiAdV 感染在特定鴿子中的相關致病過程。I 型或II 型的分類不是以抗原性差異為依據，而是以感染后引起的臨床癥狀作為分類標準[13]。I 型PiAdV（PiAdV-I，為經典腺病毒）感染的臨床癥狀與幼鴿疾病綜合征（young pigeon disease syndrome，YPDS）類似，主要影響1 歲以下的鴿，表現為腹瀉、吐食、消化緩慢和體重下降等；II 型PiAdV（PiAdV-II）可感染所有年齡段的鴿，引起的死亡率更高，臨床特征更典型，導致廣泛性的肝壞死或突然死亡[12，14]。目前還沒有針對PiAdV 的疫苗，因此PiAdV 感染給我國賽鴿及肉鴿養殖業帶來了嚴峻挑戰及經濟損失。當前，關于我國PiAdV 感染的流行病學研究較少，其在我國的分布尚不清楚。因此，開展PiAdV 的分布和流行規律研究，對我國PiAdV 感染的精準防控具有重要意義。本研究于2021—2022 年，在我國8 個省（自治區）41 個活禽交易市場，采集鴿口咽/泄殖腔雙拭子樣品，通過常規PCR 方法檢測PiAdV核酸，并對陽性樣品進行遺傳進化分析，以期為科學防控PiAdV 感染提供流行病學數據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

從江蘇、河南、安徽、江西、福建、廣東、廣西、云南等8個省（自治區）的41個活禽交易市場，隨機采集鴿的口咽/泄殖腔雙拭子樣品，共計462份。

1.2 核酸提取

采用FinaQuick 快速病毒DNA 柱式提取試劑盒（GENFINE），按照說明書進行病毒DNA 提取，將提取的DNA 立即用于PCR 擴增或者于-20 ℃保存。

1.3 PCR 擴增

根據相關研究[15]，針對PiAdV 的hexon 蛋白編碼基因保守區域設計引物，PCR 產物預期長度為616 bp，引物由青島睿博興科生物技術有限公司合成。用提取的DNA 作為模板，進行PCR 檢測。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環；72 ℃延伸5 min。擴增后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 PCR 擴增產物序列測定

PCR 擴增產物按照北京全式金快速膠回收試劑盒說明書進行純化回收，純化后的DNA 產物送至青島睿博興科生物技術有限公司進行序列測定。

1.5 遺傳進化分析

利用MEGA 6 軟件，針對腺病毒hexon 蛋白編碼基因序列，采用鄰位相連法（neighbor-joining）構建系統進化樹，分析病毒的遺傳進化特點。

2 結果

2.1 病原檢測

2.1.1 總體情況 病原檢測結果（表1～2）顯示：2021—2022 年在河南、安徽、江西、福建、廣東、廣西、云南等7 個省（自治區）24 個活禽交易市場檢出120 份PiAdV 病原陽性樣品，個體陽性率為25.97%（95%CI：21.98%～29.97%），場點陽性率為58.54%（95%CI：43.46%～73.62%）。

表1 8 個省（自治區）活禽交易市場PiAdV 檢測結果

2.1.2 地區情況 陽性場點分布范圍較廣，除江蘇省外，其他采樣省份均有陽性檢出，不同省份的PiAdV 陽性率有一定差異。其中：江西（40.00%）、廣西（39.08%）個體陽性率較高，而云南（5.56%）、安徽較低（3.13%）。

2.1.3 場點類型情況 24 個PiAdV 陽性采樣點包括17 個零售市場和7 個活禽批發市場。場點統計結果（表2）顯示，活禽批發市場的場點陽性率高于零售市場，分別為87.50%和51.52%。

表2 不同采樣點PiAdV 陽性率分布

2.2 遺傳進化分析

隨機挑選來自不同省份的15 份PiAdV 病原陽性樣品進行基因測序，測序結果經BLAST 比對發現，均符合PiAdV 序列。選取GenBank 公布的21株（表3）具有代表性的腺病毒hexon 蛋白編碼基因序列與本研究測定的hexon 蛋白編碼基因構建遺傳進化樹。結果顯示：本研究的15 份PiAdV 陽性樣品均屬于PiAdV-B 分支（圖1），與2018 年國內檢測到的PAV/FJ2017 株[14]親緣關系最近，同屬于PiAdV-B 中的varient B 小分支，核苷酸同源性為99.1%～100%，與PiAdV-B 同分支中varient A小分支的YPDS-Y-V1.A19.11 和M144 毒株的核苷酸同源性為83.3%～84.0%，而與同物種的PiAdV-A分支親緣關系較遠，與該種IDA4 分離株的核苷酸同源性只有65.0%～66.0%。

3 討論

近年來，我國養鴿業發展迅猛，鴿飼養數量逐步增加，養鴿業已經成為我國繼雞、鴨、鵝之后的第四大家禽產業。但是當前對于鴿相關疾病的系統流行病學研究較少，對疫病的種類、分布、危害

等尚不清楚。PiAdV 是鴿群中常見的病原體，其中鴿典型PiAdV 感染臨床上主要表現為嗉囊積食、腹瀉、吐食和體重下降等癥狀[16]，當其與其他病原發生混合感染或者機體抵抗力較低時，會導致鴿死亡率明顯升高，嚴重影響著養鴿業健康發展。為了解PiAdV 在我國的流行現狀，本研究對2021—2022 年在江蘇、河南、安徽、江西、福建、廣東、廣西、云南等8 個省（自治區）41 個活禽交易市場采集的鴿拭子樣品進行病原檢測，結果發現個體陽性率為25.97%，其中江西省的個體陽性率高達40.00%。史磊波[17]對西安市周邊地區采集的396份鴿泄殖腔拭子樣品進行PiAdV 核酸檢測，發現樣品陽性率為14.6%；楊俊杰[18]對呼和浩特市周邊公棚采集的107 份賽鴿泄殖腔拭子進行PiAdV檢測，發現陽性率為32.7%；習碩等[19]對北京、河北、江西、山東、河南5 個地區552 份鴿血清樣品進行PiAdV 檢測，發現血清陽性率為62.3%。以上研究表明，PiAdV 在我國鴿群中流行廣泛。

根據ICTV 分類報告，同物種的PiAdV 分為PiAdV-A 和PiAdV-B 種。本研究所測定的PiAdV均處于PiAdV-B 分支，與2018 年國內檢測到的PAV/FJ2017 株親緣關系最近，與同屬于PiAdV-B分支varient B 小分支病毒的核苷酸同源性為99.1%～100%，與PiAdV-B 同分支中varient A 小分支的YPDS-Y-V1.A19.11 和M144 分離株的核苷酸同源性為83.3%～84.0%，而與同物種的PiAdV-A種分支中的IDA4 分離株同源性較低。本研究同時使用史磊波[17]報道的針對PiAdV-A 種引物進行樣品核酸檢測，均未檢測到PiAdV-A 種病原學陽性，只檢測到PiAdV-B 種陽性，表明我國鴿群中主要流行PiAdV-B 種病毒。根據PiAdV 感染后引起的臨床癥狀差異的分類標準，本研究所采集的拭子樣品均來自活禽交易市場無明顯臨床癥狀的鴿，因此檢測到的PiAdV 均屬于PiAdV-I 型。

值得注意的是，本研究所檢測到的120 份PiAdV 病原學陽性來源于24 個采樣點，場點陽性率高達58.54%，包括17 個零售市場和7 個活禽批發市場，說明活禽批發市場和零售市場是PiAdV的高污染場點。活禽市場中禽種類繁多，存在多種禽類混養、來源復雜、市場衛生條件較差等現象，極易導致病毒傳播和混合感染。因此，應加強活禽市場的衛生消毒管理，積極采取定期休市、嚴格清洗消毒等措施。同時，本研究只針對各地區活禽交易市場鴿群的感染情況進行了初步檢測與分析，研究結果存在一定的局限性，要獲得更為準確的流行病學數據仍需結合養殖環節鴿群的檢測結果進行深入研究探討。

由于市場上暫無針對PiAdV 的專用疫苗，因此對于該病的防控，要注重加強飼養管理，增強養殖業主的生物安全意識，改善養殖環境，提高鴿群抵抗力，利用有效手段降低病毒的感染、變異和傳播風險，盡快研發PiAdV 針對性疫苗，完善防控物質儲備，提高防控能力。

4 結論

研究表明，我國市場交易鴿群中存在PiAdV流行，且部分市場污染面較廣，感染率較高，PiAdV-B 種為優勢流行毒種。建議加強鴿場的飼養管理，提高鴿群抵抗力，同時加強活禽交易市場的衛生管理，防止病毒擴散，加快開展PiAdV 疫苗研發，從而有效防控鴿腺病毒病流行。