聚合酶螺旋反應（PSR）在病原微生物快速檢測中的研究進展

焉 鑫，劉蒙達，張 力，李 巖，孫淑芳，樊曉旭

（1.中國動物衛生與流行病學中心，山東青島 266032；2.新疆生產建設兵團畜牧獸醫工作總站，新疆烏魯木齊 830000）

近十幾年來，H7N9流感、寨卡病毒病、登革熱、“非典”等新發、突發傳染病暴發逐漸增多，與此同時結核病、布魯氏菌病等傳統重要的人獸共患病也有逐漸抬頭的趨勢。特別是2019 年底暴發的新冠肺炎疫情，目前已經發展到全球大流行階段[1]。在全球一體化大背景下，快速識別感知病原微生物，對于動物健康、公共衛生安全、食品安全具有重要意義。

病原微生物檢測技術主要包括病原分離培養、免疫學檢測和核酸檢測。其中，核酸檢測技術具有敏感性高、限制因素少、易于操作等優點，目前已得到廣泛使用。自20 世紀中葉聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）發明以來，隨著分子生物學技術的不斷革新，實時熒光定量PCR 技術（real-time fluorescent quantitative PCR，RT-qPCR）[2]、環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）[3]、重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA）[4]和重組酶介導擴增技術（recombinase-aided isothermal Amplification，RAA）[5]等基于微生物核酸特異性擴增的檢測技術發展迅速。2015 年，Liu等[6]以PCR 和LAMP 檢測技術為基礎，建立了聚合酶螺旋反應（polymerase spiral reaction，PSR）檢測方法。該方法不僅保留了傳統PCR 引物設計簡單的優勢，還具有全部反應只需一種酶，無需反復加樣，在恒溫條件下即可完成反應，不易出現污染的特點，具有良好的特異性、敏感性和易操作性。本文擬從PSR 技術的原理以及在病原微生物快速檢測中的應用方面作綜述。

1 原理

1.1 擴增原理

F 段和R 段特異性引物序列結合靶基因上的Fc 和Rc 段，在BstDNA 聚合酶作用下向3'端延伸，形成DNA 雙鏈結構。該雙鏈在甜菜堿的作用下，再次解鏈為游離的DNA 單鏈。此時單鏈上的Nc段與N 段是反向互補的，根據堿基互補配對原則，Nc 段會旋轉并與N 段結合形成勾型結構，形成的3'端缺口會被BstDNA 聚合酶用堿基填補，繼續向3'端延伸。之后反復重復引物結合、延伸、解鏈、單鏈旋轉、延伸的循環，最終形成一系列相對分子質量大小不一的復雜結構，達到等溫條件下核酸擴增的目的[6]。常規PSR 反應最佳溫度一般為65 ℃，在只采用兩條主引物的前提下，大約在60 min 內完成擴增。若在體系內引入加速引物IF 和IB，則在30 min 內即可完成擴增反應。若引入逆轉錄酶建立RT-PSR 方法，也適用于RNA 的快速檢測[7]。

1.2 引物設計

基于BstDNA 聚合酶的核酸等溫擴增方法的引物設計思路：使擴增引物包括兩段先后與靶序列結合且能在擴增中折疊成環的序列，利用酶的置換活性與聚合酶活性，反復延伸、折疊、解離，最終使核酸得到擴增。單一的上下游PCR 引物無法在BstDNA 聚合酶及其反應體系下恒溫擴增核酸序列，而PSR 僅需要在PCR 引物的基礎上，從靶序列上取一段序列N，將這段序列添加到PCR 引物（F和R）的5'端，構成兩條復合引物Ft 和Bt。引物組成及其在靶序列上的結合位點如圖1-A 所示。這兩條引物就是PSR 反應的主引物。若要進一步提高檢測速度及靈敏性，可以分別在F 與N 以及B 與N 之間，從5'端到3'端的方向分別與Ft、Bt相反設計加速引物IF 和IB。IF 和IB 在靶序列上的位置示意圖如圖1-B 所示。由于都是基于酶的鏈置換活性原理，PSR 引物設計可參考LAMP 引物設計規則。具體的設計參數如表1 所示，按表1 中的參數進行引物設計，將提高PSR 擴增反應的成功率。

表1 PSR 引物最佳設計參數[8]

1.3 擴增產物判讀方式

PSR 擴增產物的判讀方式有以下3 種：一是采用實時濁度儀進行濁度的實時監測。該方法可精確得到Ct 值的出峰時間。二是通過瓊脂糖凝膠電泳進行結果判定。三是采用指示劑顯色法，即將顏色指示劑加入到PSR 反應體系中，通過陰陽性反應的顏色差異，肉眼快速判斷試驗結果。目前常用的顏色指示劑有SYBR Green I 指示劑[6-7]、鈣黃綠素（Calcein）指示劑、羥基萘酚藍指示劑和pH 顏色指示劑[8-9]。實時濁度儀判斷法和瓊脂糖凝膠電泳判定法均需要專業的儀器及相對復雜的操作，用于實驗室研究尚可，不適用現場快速檢測；而指示劑顯色法結果判讀簡單，不需要復雜的儀器及操作，適合現場快速檢測。

2 應用

2.1 病毒檢測

2.1.1 人獸共患病病毒 Sun 等[10]開發了5'UTR-PSR 方法檢測丙型肝炎病毒（HCV）。該方法有良好的特異性和敏感性，可識別所有基因型的HCV，而不與其他病毒發生非特異性反應，檢出限可達25 copies/mL，與RT-qPCR 相當，比RTLAMP 高2 倍，且縮短了檢測時間。Sharma 等[7]將簡化的磁珠RNA 提取法與RT-PSR 相結合，開發了基孔肯雅病毒（CHIKV）的早期篩查方法。該方法的檢測限為10 個RNA 拷貝，與RT-qPCR相當，并且檢測特異性良好。Tomar 等[11]建立了西尼羅病毒（WNV）的RT-PSR 檢測方法，其靈敏性為1 個RNA 拷貝，比普通RT-PCR 靈敏性提升100 倍，與黃病毒、甲病毒和麻疹病毒無交叉反應；對107 份臨床樣本檢測發現，RT-PSR 與RTqPCR 一致性為100%。He 等[12]針對柯薩基病毒A16（CVA-16）VP1編碼區保守序列設計特異性引物，建立了CVA-16VP1RT-PSR 檢測方法，其模板RNA可在恒溫條件下40 min內完成逆轉錄擴增，檢出限為2.4×（101～102）copies/mL，且具有良好的特異性。

2.1.2 動物疫病病毒 Wo?niakowski 等[13]基于黑寡婦α-latrotoxin（位置：180～199）（GenBank登錄號：KF751511.1）、格魯吉亞ASFV 2007/1核衣殼蛋白p72（位置：104 980～104 999 和105 116～105 135）和交聯引物AB 建立了聚合酶交聯螺旋反應（PCLSR）檢測方法。該方法在65 ℃45 min 內即可完成擴增，檢測P72基因片段的靈敏性為7.2×102copies/μL，且與豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）均無交叉反應，為現場檢測非洲豬瘟病毒（ASFV）提供了方法和支撐。Ji 等[14]建立了豬圓環病毒3 型（PCV3）ORF2-PSR 檢測方法。該方法的最優反應溫度和時間是62 ℃ 50 min，檢測靈敏度與LAMP 相當，達1.13×102copies/μL，且與豬偽狂犬病病毒（PRV）、PRRSV、豬圓環病毒2 型（PCV2）、CSFV 和PEDV 均無交叉反應；從臨床樣本的檢測結果看，ORF2-PSR 與LAMP檢測方法的符合率接近100%。Wang 等[15]建立的ORF3-PSR 方法能夠在62 ℃ 50 min 檢測到PEDV核酸的擴增，且靈敏性比普通RT-PCR 高10 倍。Gupta 等[16]建立了犬細小病毒2 型（CPV2）VP2-PSR 檢測方法，最優反應溫度和時間是64 ℃75 min，最低檢出限是5×10-6ng DNA，靈敏度比普通PCR 高10 倍，與RT-qPCR 和LAMP 等方法相當。此外，針對牛皰疹病毒I 型（BHV1）設計特異性引物建立的PSR 方法，經證實也具有良好的特異性和敏感性[17]。

2.2 細菌檢測

2.2.1 人獸共患病病原菌 在建立的多種人獸共患病病原菌及食源性病原菌PSR 檢測方法中，針對流產型布魯氏菌，Ashmi 等[18]建立了BruAb2_0168-PSR 方法。該方法特異性好，65 ℃水浴60 min 可最低檢測到1.33 fg DNA，靈敏度比普通PCR 高10 000 倍，與RT-qPCR 相當。此外，針對布魯氏菌疫苗株S19，IS711-PSR 檢測方法在保證特異性的前提下，靈敏度較普通PCR 提高了100 倍[19]。Liu 等[20]建立了結核分枝桿菌PSR 檢測方法，并據此開發了新型現場核酸快速檢測試劑盒。該試劑盒穩定性好、特異性強，DNA 最低檢出限是0.92 pg/μL，從臨床樣品檢測結果看，與RT-qPCR 的符合率為91.6%。

2.2.2 食源性病原微生物 近年來，食源性病原微生物感染越來越受到重視。Xu 等[21]收集了涉及豬肉、牛肉、羊肉、魚肉、雞肉以及蔬菜等的532份食品樣本，針對食品沙門氏菌污染問題建立了invAPSR 檢測方法。該方法最低檢出限是50 CFU/mL，靈敏度與LAMP 和RT-qPCR 一致。He 等[22]建立了檢測副溶血弧菌的tlh-PSR 方法。該方法的核酸最低檢出限是300 fg/μL，純培養最低檢出限是2.4 CFU/mL，在65 ℃ 40 min 內即可完成反應，靈敏度較普通PCR 提高了100 倍。此外，肺炎克雷伯桿菌和銅綠假單胞菌等院內感染細菌同樣可以應用PSR 方法進行檢測[23]。

2.3 其他病原

除了應用于病毒和細菌檢測，PSR 也應用于真菌及衣原體診斷檢測領域。白色念珠菌是最重要的人類機會性致病菌，當機體免疫功能下降或菌群失調時，白色念珠菌會大量繁殖，引起黏膜皮膚念珠菌病或侵襲性念珠菌病等疾病。Jiang 等[24]建立了白色念珠菌ITS2-PSR 檢測方法。該方法的核酸最低檢出限是6.9 pg/μL，靈敏度比普通PCR 高10倍。滑液囊衣原體能夠引起雞群的滑液囊衣原體病，導致感染雞群出現關節腫脹、跛足，蛋雞出現蛋殼異型、產蛋量下降等癥狀。Wu 等[25]建立的vlh-PSR 方法在62 ℃和40 min 內可檢測到滑液囊衣原體核酸的擴增，特異性良好，且靈敏度較普通PCR 提高了100 倍。

3 總結和展望

在全球一體化，同一個世界，同一個健康的大背景下，新冠肺炎、埃博拉、結核病、布魯氏菌病等新發病和人獸共患病防控越來越受到國際社會和世界各國的重視。盡早發現感染個體，是在源頭控制疫病傳播流行的關鍵，也是降低疫情防控成本的最適手段。因此，針對病原微生物非常有必要開發新型的快速便攜式檢測方法。PSR 是一種基于LAMP 和PCR 發展起來的新型病原微生物核酸檢測技術，其一方面解決了LAMP 引物設計復雜的問題，另一方面較PCR 檢測靈敏度高。特別是，相比于PCR、RT-qPCR，PSR 在保留高度特異性、敏感性的基礎上，不需要精密復雜的變溫儀器，并且加入顯色染料后，可以用肉眼直觀判定結果，這符合世界衛生組織（WHO）對疾病快速診斷的要求，對提升基層傳染病快速檢查、篩查能力有重要的應用價值。另外，PSR 的反應溫度為65 ℃，避免了RPA/RAA 技術在常溫下擴增可能造成的核酸污染假陽性問題。PSR 自2015 年建立以來發展迅猛，但還有很多重要病原體，例如新冠病毒、幽門螺旋桿菌、弓形蟲等的PSR 方法未見報道。隨著PSR技術的不斷發展和完善，該技術以及衍生技術將在病原微生物檢測方面具有更廣闊的應用前景。