HPLC測定蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量的不確定度評定

豐杰

蘇黃止咳膠囊源于中日友好醫院中醫呼吸科主任醫師晁恩祥教授四十余年對呼吸疾病的臨床實踐積累和研究成果，晁教授認為“咳嗽變異性哮喘”符合中醫“風性善行數變”的特點，屬于“風咳”的范疇，確定了疏風宣肺、解痙止咳的主要治法。蘇黃止咳膠囊處方由麻黃、紫蘇葉、地龍、蟬蛻等9味中藥材組成，用于風邪犯肺，肺氣失宣所致的咳嗽等。用于感冒后咳嗽和咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）的治療。處方中，麻黃和紫蘇葉為君藥，麻黃用于發汗散寒，宣肺平喘，利水消腫；紫蘇葉用于解表散寒，行氣和胃。因此，檢測、評價蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛的含量，對物質用量與臨床療效研究，具有重要意義。參考《測量不確定度評定與表示》及相關技術規范[1-3]內容，對蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛的含量測定結果進行測量不確定度評價。通過識別、計算紫蘇醛含量測定過程中的各不確定度影響因素，分析不確定度分量對紫蘇醛含量檢測結果的影響，為客觀評價紫蘇醛含量測定結果提供了分析數據。通過分析不確定分量的占比，針對性的采取預防或改進措施，提高檢驗結果的準確度，減少檢測引入的不確定度值[4-6]。

1 實驗準備

高效液相色譜儀（廠家：安捷倫，產地：美國，型號Agilent 1100），梅特勒-托利多XS205電子天平，上海能信SB3200T超聲波清洗儀，超純水儀；紫蘇醛對照品（購自中國食品藥品檢定研究院，批號111806-201303，純度為95.1%）。蘇黃止咳膠囊，國藥準字Z20103075，規格：0.45 g，由生產廠家揚子江藥業集團北京海燕藥業有限公司提供。色譜純甲醇，超純水，其它試劑為分析純。

2 實驗內容

2.1 實驗色譜條件

島津色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（68∶32）；流速0.8 mL/min；檢測波長230 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。

2.2 實驗方法

2.2.1 制備對照品溶液 精密稱量紫蘇醛對照品149.1 mg，置于50 mL棕色容量瓶，加甲醇溶解、搖勻，稀釋定容至50 mL， 配成2.836 g/L的紫蘇醛對照品溶液。精密量取此對照品溶液 1 mL置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解、搖勻、稀釋至刻度，得56. 72 mg/L的紫蘇醛對照品溶液。

2.2.2 制備供試品溶液 精密稱定蘇黃止咳膠囊內容物5 g，放入內有數粒玻璃珠的圓底磨口燒瓶內（500 mL），加入150 mL蒸餾水后，安裝揮發油提取器，并從提取器上端加水至溢流入燒瓶為止，再加入乙酸乙酯1.0 mL，連接回流冷凝器，加熱至沸，并保持微沸4 h。待圓底燒瓶及揮發油提取器放冷至室溫后，取乙酸乙酯層，加入色譜甲醇定容至5 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

3 評定不確定度

按照測量不確定度評定的步驟，從測量操作的人員、測量所使用的儀器/器皿、測量使用的方法、測量所處的環境等方面全面考慮，分析紫蘇醛含量測定過程的不確定度來源[7-9]。

3.1 建立測量模型

供試品中紫蘇醛含量的計算公式是[10-11]：

上式中，X為紫蘇醛的含量（mg/g）；C對是紫蘇醛對照品溶液的濃度（mg/L）；A供為供試品溶液中紫蘇醛的色譜峰峰面積；V供為供試品溶液的體積（mL）；m供是蘇黃止咳膠囊稱樣量（g）；A對是對照品溶液中紫蘇醛的色譜峰峰面積。其中，m對為紫蘇醛對照品稱樣量（mg）；V50、V1為紫蘇醛對照品配置所需溶劑的體積（mL）。

3.2 評定分析不確定度分量

3.2.1 紫蘇醛對照品溶液引入的不確定度 紫蘇醛對照品溶液引入的不確定度來自紫蘇醛溶液的配置和檢測。紫蘇醛溶液配置的不確定度，來自紫蘇醛質量引入的不確定度、稀釋溶解過程引入的不確定度。而紫蘇醛質量的不確定度來源于其純度和稱樣量[12-14]。

3.2.1.1 紫蘇醛純度引入的不確定度 紫蘇醛對照品純度為95.1 %，使用說明書無不確定度信息，故不考慮純度引入的不確定度，即紫蘇醛純度的相對標準不確定度urel（P對）=0。

3.2.1.2 紫蘇醛稱重引入的不確定度 天平重復稱重引入的不確定度：稱量紫蘇醛的電子天平，其檢定證書提供重復性誤差為±0.05 mg，按均勻分布計算其標準不確定度是：

天平的示值允許誤差引入的不確定度：稱量紫蘇醛的電子天平的最大允差為±0.1 mg（d=0.01 mg），按均勻分布計算其標準不確定度是：

由于紫蘇醛采用減重法稱量，即兩次稱量值之差，每次稱量均受隨機影響和天平校準的影響。故減重稱量過程引入的不確定度：

因而對照品紫蘇醛稱量的相對標準不確定度分別是：

3.2.1.3 紫蘇醛溶液配制引入的不確定度 紫蘇醛溶液配置過程中引入的不確定度，主要從配置容器校準引入，以及溶液配置時、配置容器和溶液的溫度與配置容器體積校準時的溫度差異引入[15-16]。該配置過程涉及容器主要由移液管、容量瓶。

其中，配置容器校準引入的不確定度：紫蘇醛溶液配制過程中，使用了1 mL定量移液管、5 mL容量瓶、50 mL容量瓶，其校準證書中允許誤差分別為±0.007 mL、±0.015 mL與±0.1 mL。按三角分布計算，以上玻璃儀器校準的相對不確定度則分別是：

紫蘇醛溶液配置時，配置容器和溶液的溫度與配置容器體積校準時的溫度存在差異引入的不確定度：紫蘇醛溶液和配置容器的溫度為25℃，與配置容器校正時的溫度（20 ℃）有 ±5 ℃的溫差，水的膨脹系數是2.1×10-4mL/℃，按矩形分布計算，配置溫差導致的相對不確定度是：

因而，制備對照品溶液不同稀釋體積引起的相對不確定度是：

故制備對照品溶液引入的相對不確定度是：

制備供試品溶液而引起的相對不確定度是：

3.2.1.4 紫蘇醛色譜峰檢測引入的不確定度 紫蘇醛色譜峰檢測引入的不確定度，主要由紫蘇醛溶液重復進樣引起的，對照品溶液連續進樣6針重復測量的峰面積分別是：974.4、969.9、967.7、964.7、962.7、963.7，平 均 值 為967.18，其峰面積測量的標準不確定度按照貝塞爾公式計算，得：

那么，由紫蘇醛溶液色譜峰檢測（峰面積）引入的相對不確定度是：

綜上，紫蘇醛溶液引入的相對不確定度是：

3.2.2 供試品溶液含量測定的不確定度評估 與3.2.1項相同，供試品溶液中紫蘇醛含量測定的不確定度，來自于供試品的溶液濃度和色譜峰檢測等。供試品的溶液濃度引入的不確定度，主要是蘇黃止咳膠囊稱重和配制過程稀釋體積引入的不確定度。供試品溶液色譜檢測引入的不確定度來自于儀器。

3.2.2.1 蘇黃止咳膠囊稱重引入的不確定度 天平重復稱重引入的不確定度：稱量供試品的電子天平（d=0.1 mg），校準證書顯示重復性誤差是±0.1 mg，按均勻分布計算其標準不確定度為：

同時，天平的最大允差為±1.0 mg（d=0.1 mg），按均勻分布計算其標準不確定度為：

根據實際稱量過程，還應該考慮減重法稱量過程引入的不確定度，一次稱量所引入的不確定度為：

由于試驗平行稱取兩份供試品，重量分別為5.048 6 g、5.104 3 g，每份供試品稱重的相對標準不確定度是：

故，供試品稱重引入的相對標準不確定度是：

3.2.2.2 供試品配制過程稀釋體積引起的相對不確定度 供試品溶液制備引起的相對標準不確定度，即：

3.2.2.3 供試品的色譜峰峰面積引起的相對不確定度 供試品的色譜峰峰面積是采取雙樣平行法測定的，其中，供試品溶液1的色譜峰峰面積是934，930.6，平均峰面積為932.3，兩者差值R1=3.4；供試品溶液2的色譜峰峰面積是973.2，968.2，平均峰面積為970.7，差值R2=5。按照極差法計算，n=2時，極差系數C=1.13。故：

則蘇黃止咳膠囊溶液的峰面積引入的相對不確定度為：

綜上，蘇黃止咳膠囊供試品溶液相對不確定度：

3.3 計算合成不確定度

檢測蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量結果的合成不確定度是：

3.4 計算擴展不確定度

檢測蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量的結果符合正態分布，置信概率為95%，包含因子k為2，本實驗的相對擴展不確定度是：

3.5 報告測量不確定度

檢測蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量的結果，表示為X=（16.6±0.188）μg/g。在含量測定過程中，各類來源的不確定度對總不確定度的貢獻具體如表1所示。數據顯示，供試品的稱樣量、供試品中紫蘇醛的峰面積是導致蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量測定分析中不確定度的最大影響因素。

表1 不確定度分量來源及占比

4 分析與討論

通過對蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量進行不確定度分析評價，計算出檢測蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量結果的擴展不確定度是0.188 μg/g，紫蘇醛的含量結果是（16.6±0.188）μg/g。不確定度評價結果提示，峰面積、稀釋體積對蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量測定的不確定度的影響相對較大，特別是供試品中紫蘇醛的峰面積、對照品的配制稀釋倍數，是檢測蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量的分析過程中最大的影響因素。對于供試品檢測引入的不確定度，可以對高效液相進行定期計量及期間核查，日常開展維護保養，提高儀器檢測的準確性和靈敏度，減少測量設備引入的不確定度。同時，適當增大供試品的稱樣量及進樣體積，增加供試品峰面積，減少樣品本身可能引入的不確定度。針對對照品稀釋倍數引入的不確定度分量，適當減少對照品的稱樣量及減少稀釋步驟，減少不確定度引入的比重。

此次評定可用于蘇黃止咳膠囊中紫蘇醛含量檢測結果的質量評價。在日常檢驗中，明確操作細節和日常的管理要求，盡可能減少隨機效應引入的測量不確定度[17-19]。此外，在實驗室認可時，實驗室的測量能力也是通過測量范圍及在該測量范圍內相應的測量不確定度表述的，也就是說測量不確定度評定在藥物分析中有著重要作用。