STAT1和組蛋白乙酰化修飾調(diào)控雞lncRNA-BMP4轉(zhuǎn)錄研究

高曉敏，周舒簡，陳 晨，金 晶，胡 菜，張 晨，左其生，張亞妮，陳國宏，李碧春，2

(1.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，中國教育部國際農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212003)

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一種不編碼蛋白質(zhì)的RNA，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮著重要作用[1]。近年來研究表明，lncRNA廣泛參與生命活動，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡[2]，以及胚胎發(fā)育。因此，lncRNA的功能和調(diào)控機(jī)制的闡明對現(xiàn)代生命科學(xué)具有重要意義。原始生殖細(xì)胞是精子和卵子的祖細(xì)胞，雞原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)有隨血液遷移的特點(diǎn)，受許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控因素的調(diào)節(jié)。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，lncRNA在調(diào)控生殖細(xì)胞分化中起著非常重要的作用[3]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP4)可誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)分化為生殖細(xì)胞，在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入BMP4可以導(dǎo)致生殖細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)[4]。本研究前期通過分析篩選雞ESCs、PGCs、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一條lncRNA(TCONS_00874170)，預(yù)測其靶基因?yàn)锽MP4，將其命名為lncRNA-BMP4[5]。其在PGCs上特異性高表達(dá)，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制并不清楚。lncRNA的表達(dá)具有時空特異性，而導(dǎo)致其特異性的主要原因是啟動子的活性不同[6]。

轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾是影響啟動子活性的主要因素[7]。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，lncTCF7的啟動子區(qū)能與SWI/SNF復(fù)合物結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)，從而激活Wnt信號。除轉(zhuǎn)錄因子的影響外，表觀遺傳因素也會影響lncRNA啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。DNA甲基化主要是與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)的表觀遺傳修飾類型[9]。一些lncRNAs是通過其啟動子區(qū)域CpG位點(diǎn)的甲基化缺失而被表觀激活的[10]。研究表明，組蛋白乙酰化修飾是基因表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制[11]。組蛋白H3k27乙酰化激活lncRNA PAXIP1-AS1可影響卵巢癌的發(fā)生[12]。多種物質(zhì)可通過調(diào)控組蛋白乙酰化水平影響lncRNA的表達(dá)[13]。鑒于此，本研究通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)確定lncRNA-BMP4的核心啟動子區(qū)域，并通過順反式驗(yàn)證了影響啟動子核心區(qū)域表達(dá)的因素，以期為系統(tǒng)解析影響lncRNA的表達(dá)因素提供新思路，為詳細(xì)解析lncRNA-BMP4的功能和分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶AseⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ及2×SuperReal Color、PreMix Prime STAR Mix均購自TaKaRa公司；1×抗真菌/抗菌劑(100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)購自Invitrogen公司；胰酶、高糖DMEM、10%胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)、TRNzol Universal總RNA提取試劑(DP424)、FastKing一步法反轉(zhuǎn)錄-熒光定量試劑盒(SYBR Green，F(xiàn)P313)均購自天根生化科技(北京)有限公司；FuGENE?HD(E2311)和雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)均購自Promega公司；超級感受態(tài)、引物合成及測序均由北京擎科生物公司完成。pGL3-Basic載體、pEGFP-N1載體、雞成纖維細(xì)胞系(DF-1)均由中國教育部國際農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全研究聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室保存。

超低溫離心機(jī)、超低溫冰箱、熒光酶標(biāo)儀和細(xì)胞培養(yǎng)箱均購自Thermo公司；熒光倒置顯微鏡購自O(shè)lympus公司；熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)均購自Bio-Rad公司；水浴鍋購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 lncRNA-BMP4啟動子克隆

根據(jù)軟件Softberry(http:∥linux1.softberry.com/berry.phtml topic=service)預(yù)測的lncRNA-BMP4啟動子序列設(shè)計啟動子全長擴(kuò)增引物，引物序列為：F:5′-CCCATTAATGAGCCACTCTGTT-TCGCATT-3′(下劃線處為AseⅠ酶切位點(diǎn))；R:5′-CCCAAGCTTACCACTGAGCCATTCTTGGA-3′(下劃線處為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

通過血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取雞肌肉基因組DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系20 μL：Prime STAR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將鑒定正確的lncRNA-BMP4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后與pEGFP-N1載體連接，經(jīng)AseⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，酶切鑒定正確后交于北京擎科生物公司測序，構(gòu)建plncBMP4-N1載體。

1.3 lncRNA-BMP4啟動子系列缺失載體構(gòu)建

以lncRNA-BMP4全長為模板，固定3′-端逐步縮短5′-端，分別設(shè)計啟動子不同缺失片段的引物，引物信息見表1。PCR擴(kuò)增體系及程序同1.2。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行目的產(chǎn)物純化回收，經(jīng)XhoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后連接到無啟動子的pGL3-Basic載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化超級感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單克隆菌落進(jìn)一步測序鑒定，構(gòu)建雞lncRNA-BMP4的一系列5′-端缺失載體(圖1)。篩選到核心區(qū)域后，采用相同方法分別構(gòu)建全長啟動子核心區(qū)域缺失的載體pGL3-DE-p4-p5，以及只含有核心區(qū)域的載體pGL3-p4-p5。將這2個載體與8個缺失載體分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，并進(jìn)行雙熒光素報告基因檢測，進(jìn)一步確定啟動核心區(qū)域位置。

表1 lncRNA-BMP4擴(kuò)增引物序列

圖1 lncRNA-BMP4啟動子系列缺失載體引物設(shè)計模式圖

1.4 生物信息學(xué)分析

通過轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)站 Jaspar(http:∥jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)預(yù)測lncRNA-BMP4核心啟動子區(qū)域可能發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子，分別為性別決定區(qū)Y的盒內(nèi)基因17(SOX17)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)。運(yùn)用MethPrimer軟件對lncRNA-BMP4啟動子區(qū)進(jìn)行分析，預(yù)測CpG島。使用GC含量在線計算網(wǎng)站(http:∥www.detaibio.com/tools/gc-content.html)對其啟動子區(qū)的GC含量進(jìn)行分析。

1.5 點(diǎn)突變試驗(yàn)

在pGL3-p4-p5質(zhì)粒基礎(chǔ)上分別將SOX17、CREB1、STAT1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)缺失，重新插入pGL3-Basic載體中，命名為pGL3-SOX17 mut、pGL3-CREB1 mut和pGL3-STAT1 mut。將pGL3-p4-p5、3個突變載體與內(nèi)參質(zhì)粒sv40共轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞樣品進(jìn)行雙熒光素酶活性驗(yàn)證，比較SOX17、CREB1、STAT1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變后是否影響lncRNA-BMP4的啟動子活性。

1.6 STAT1干擾載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI中雞STAT1基因序列(登錄號：NM_001012914.2)設(shè)計3條干擾序列及1條陰性對照序列(shNC)。將干擾靶點(diǎn)反向互補(bǔ)拼接，在其中插入Loop環(huán)(TTCAAGAGA)，然后在上、下游引物的5′-端分別引入BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)，并在上游引物的3′-端插入AAAAAA，在下游引物的5′-端加入TTTTTT，形成shRNA Oligo，序列見表2。取shRNA Oligo上、下游引物各5 μL進(jìn)行退火。退火程序：95 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，37 ℃ 2 min，25 ℃ 2 min。退火產(chǎn)物連接到經(jīng)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGLMV-SC5干擾載體上，重組載體分別命名為shSTAT1-1、shSTAT1-2和shSTAT1-3。

表2 轉(zhuǎn)錄因子STAT1干擾載體引物

續(xù)表

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含10%胎牛血清和1×抗真菌/抗菌劑(100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)DF-1細(xì)胞。將DF-1細(xì)胞以1×105/孔均勻地鋪在24孔板中，24 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，選擇生長狀態(tài)良好且匯合度達(dá)70%左右時細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將目的質(zhì)粒1 μg、sv40內(nèi)參質(zhì)粒30 ng、Opti-MEM補(bǔ)足50 μL與3 μL FUGENE、47 μL Opti-MEM混勻至100 μL，37 ℃孵育15 min。在每個孔中輕輕加入100 μL轉(zhuǎn)染混合液，48 h后觀察熒光表達(dá)并拍照。

1.8 雙熒光素酶活性檢測

按照雙熒光素酶試劑盒操作步驟收集1.7中的細(xì)胞，去掉培養(yǎng)液，用預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞。胰酶消化后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，離心棄上清，在每管中加入70 μL稀釋過的裂解液，重懸細(xì)胞后，室溫靜置10 min，再轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板中；設(shè)置好熒光參數(shù)后，分別在每個樣品孔中加入70 μL螢火蟲熒光液，于酶標(biāo)儀中讀取550 nm下的螢火蟲熒光值；結(jié)束后再在板中加入同等體積的STOP液，淬滅螢火蟲熒光，激活海參熒光，于酶標(biāo)儀中讀取480 nm下的海參熒光值。螢火蟲熒光值/海腎熒光值即為啟動子活性。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3個獨(dú)立重復(fù)。

1.9 實(shí)時熒光定量PCR檢測STAT1基因表達(dá)量

收集分別轉(zhuǎn)染shSTAT1-1、shSTAT1-2和shSTAT1-3的DF-1細(xì)胞，以不轉(zhuǎn)染組為空白對照，以轉(zhuǎn)染pGLMV-SC5-Negative組為陰性對照(NC)，用Trizol法提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×SuperReal Color PreMix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，65 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.10 表觀遺傳修飾對lncRNA-BMP4啟動活性的影響

為了探究組蛋白乙酰化是否影響lncRNA-BMP4的轉(zhuǎn)錄水平，將核心啟動子轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后，添加終濃度為1 μmol/L的曲古抑菌素(trichostatin，TSA)，與同處理但不加TSA做對比，以轉(zhuǎn)染pGL3-Basic載體為空白對照。處理48 h后，各組收樣進(jìn)行雙熒光素酶檢測組蛋白乙酰化對 lncRNA-BMP4啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。

為了探究DNA甲基化是否影響lncRNA-BMP4的轉(zhuǎn)錄水平，將核心啟動子轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后，添加終濃度為10 μmol/L的5′-Azadc(5′-Aza-2′-deoxycytidine)，與同處理但不加5′-Azacd做對比，以轉(zhuǎn)染pGL3-Basic載體為空白對照。處理48 h后，各組收樣進(jìn)行雙熒光素酶檢測DNA甲基化對lncRNA-BMP4啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響。

1.11 統(tǒng)計分析

根據(jù)公式2―ΔΔCt計算相對表達(dá)量，統(tǒng)計學(xué)處理采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)檢驗(yàn)，并利用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行作圖。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA-BMP4啟動子活性定性分析

通過PCR擴(kuò)增得到1 288 bp的lncRNA-BMP4啟動子片段(圖2)，測序結(jié)果顯示，plncBMP4-N1重組載體構(gòu)建成功。將plncBMP4-N1載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48 h后觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，但其表達(dá)的亮度低于pEGFP-N1載體轉(zhuǎn)染組(圖3)。表明預(yù)測的lncRNA-BMP4啟動子有啟動活性。

M，DL5000 DNA Marker；1～8，lncRNA-BMP4啟動子序列擴(kuò)增

圖3 plncBMP4-N1重組載體活性驗(yàn)證(100×)

2.2 lncRNA-BMP4啟動子活性核心區(qū)域篩選

采用預(yù)設(shè)計的8對引物，以plncBMP4-N1為模板擴(kuò)增系列缺失片段，電泳結(jié)果分別出現(xiàn)大小約為1 288、1 104、947、850、669、491、328和166 bp的8條帶(圖4)，均與預(yù)期大小相符，表明啟動子系列缺失片段擴(kuò)增成功。將系列缺失片段插入pGL3-Basic載體中，構(gòu)建出8個重組熒光素缺失載體，采用雙熒光素報告基因檢測lncRNA-BMP4各片段啟動子活性的變化，結(jié)果顯示，從―1 270 bp逐步截短至―832 bp時啟動子的活性未發(fā)生顯著變化，而從―832 bp截短至―651 bp時啟動子的活性極顯著下降(P<0.01)，且在后續(xù)繼續(xù)截短時啟動活性未出現(xiàn)顯著變化(圖5)。初步判斷―832～―651 bp為lncRNA-BMP4啟動子的核心區(qū)域。

M，DL5000 DNA Marker；1～16，P1～P4片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；17～32，P5～P8片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同

進(jìn)一步構(gòu)建只含有活性區(qū)域的pGL3-p4-p5載體和此區(qū)域完全缺失的pGL3-DE-p4-p5載體，雙酶切結(jié)果顯示分別切出約191和1 099 bp片段(圖6)，將雙酶切成功的載體送測序，結(jié)果表明2個載體均構(gòu)建成功。為驗(yàn)證該區(qū)域是否為啟動子活性核心區(qū)域，試驗(yàn)分別將后構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)入DF-1細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)僅含有活性區(qū)域(―832～―651 bp)的pGL3-p4-p5載體啟動活性極顯著高于核心啟動子區(qū)完全缺失的pGL3-DE-p4-p5載體(P<0.01)(圖7)。說明―832～―651 bp為lncRNA-BMP4啟動子的核心區(qū)域。

M，DL5000 DNA Marker；1、4，pGL3-p4-p5和pGL3-DE-p4-p5質(zhì)粒；2、5，pGL3-p4-p5和pGL3-DE-p4-p5質(zhì)粒單酶切；3、6，pGL3-p4-p5和pGL3-DE-p4-p5質(zhì)粒雙酶切

圖7 雙熒光素酶試驗(yàn)篩選啟動子核心區(qū)域

2.3 lncRNA-BMP4關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的篩查

單酶切結(jié)果顯示在約5 000 bp處存在目的條帶，表明pGL3-SOX17 mut、pGL3-CREB1 mut和pGL3-STAT1 mut載體構(gòu)建成功(圖8)。將3個缺失重組載體和野生型pGL3-p4-p5載體分別轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，雙熒光素酶結(jié)果顯示，與pGL3-p4-p5載體相比，缺失SOX17或CREB1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)均不能顯著影響核心啟動區(qū)域的活性；而缺失了STAT1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的載體則極顯著降低了核心啟動區(qū)域活性(P<0.01)(圖9)。表明STAT1是影響lncRNA-BMP4轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

圖9 雙熒光素酶驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子SOX17、CREB1及STAT1的作用

2.4 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT1的功能檢測

本研究成功構(gòu)建了3個STAT1干擾載體(shSTAT1-1、shSTAT1-2、shSTAT1-3)，對其干擾效率進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，shSTAT1-1、shSTAT1-2和shSTAT1-3與陰性對照組間差異不明顯(圖10)。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，與對照組相比，shSTAT1-1、shSTAT1-3極顯著干擾了STAT1的表達(dá)(P<0.01)，shSTAT1-2顯著干擾了STAT1的表達(dá)(P<0.05)，且shSTAT1-1干擾作用強(qiáng)于shSTAT1-3(圖11)。因此以shSTAT1-1干擾載體進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)。

圖10 STAT1干擾載體活性驗(yàn)證(100×)

圖11 STAT1干擾載體效率檢測

將shSTAT1-1干擾載體與啟動子核心區(qū)域pGL3-p4-p5載體共轉(zhuǎn)染，以單轉(zhuǎn)pGL3-p4-p5為對照，雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，干擾STAT1后lncRNA-BMP4啟動子活性核心區(qū)域的啟動活性極顯著下降(P<0.01)(圖12)。提示轉(zhuǎn)錄因子STAT1能促進(jìn)lncRNA-BMP4的轉(zhuǎn)錄。

圖12 雙熒光素酶驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子的作用

2.5 表觀遺傳修飾對lncRNA-BMP4啟動活性的影響

生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)在lncRNA-BMP4啟動子區(qū)存在高GC含量(圖13)。將核心啟動子轉(zhuǎn)染DF-1后添加DNA甲基化抑制劑5′-Azacd，與同處理但不加5′-Azacd進(jìn)行對比，雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，添加5′-Azacd不影響lncRNA-BMP4的轉(zhuǎn)錄活性(P>0.05)；將核心啟動子轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后，添加組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA，與同處理但不加TSA進(jìn)行對比，雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，添加TSA后極顯著提高了lncRNA-BMP4的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.01，圖14)。

圖13 lncRNA-BMP4啟動子區(qū)域CpG島(A)和GC位點(diǎn)(B)預(yù)測

圖14 DNA甲基化和組蛋白乙酰化對lncRNA-BMP4啟動活性的影響

3 討 論

基因表達(dá)的時空順序受多種表達(dá)調(diào)控機(jī)制，轉(zhuǎn)錄起始是最主要的調(diào)控方式之一，所以深入探究啟動子對基因表達(dá)的影響尤為重要。本研究使用擴(kuò)增的lncRNA-BMP4啟動子替換pEGFP-N1載體的CMV啟動子，進(jìn)一步采用固定3′-端、逐段縮短5′-端的逐段截短法，構(gòu)建啟動子的系列缺失雙熒光素酶報告載體，分別鑒定每個片段的啟動活性。通過相鄰2個載體的活性差異，確定了―832～―651 bp是lncRNA-BMP4啟動子的活性核心區(qū)域，并在此基礎(chǔ)上通過Jaspar網(wǎng)站預(yù)測了可能發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子，分別為SOX17、CREB1、STAT1。

3.1 轉(zhuǎn)錄因子STAT1激活lncRNA-BMP4的表達(dá)

轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控基因表達(dá)的重要因素，它可以結(jié)合到基因的啟動子區(qū)域，與RNA聚合酶形成復(fù)合物，來提高RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄效率。轉(zhuǎn)錄因子及與其結(jié)合的啟動子中的相關(guān)順式作用元件在基因表達(dá)方面起著開關(guān)作用[14]。轉(zhuǎn)錄因子既可以正向調(diào)控基因表達(dá)也可以抑制基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子ACSL1和ASCL2可激活家族序列相似性13成員A(family with sequence similarity 13 member A，F(xiàn)AM13A)基因的轉(zhuǎn)錄[15]；轉(zhuǎn)錄抑制因子VIVIPAROUS1/ABI3-LIKE1(VAL1)和VAL2可抑制多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)基因的轉(zhuǎn)錄[16]。轉(zhuǎn)錄因子是信號通路下游的效應(yīng)器，通過接受信號通路的信號來啟動基因的表達(dá)。研究表明，STAT1可激活lncRNA的表達(dá)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子STAT1能正向調(diào)控lncRNA-BMP4的表達(dá)，而前期研究表明，lncRNA-BMP4能夠正向調(diào)節(jié)PGCs的形成[5]，而STAT1也是正向調(diào)控PGCs形成的重要轉(zhuǎn)錄因子[18]。綜上，STAT1可通過調(diào)控lncRNA-BMP4的表達(dá)來調(diào)控PGCs發(fā)育。

3.2 DNA甲基化對lncRNA-BMP4啟動子活性的影響

DNA甲基化是表觀遺傳修飾中調(diào)控基因表達(dá)最多的一個修飾。DNA甲基化是基因組DNA中胞嘧啶的共價修飾，在脊椎動物中主要發(fā)生在CpG二核苷酸，即CpG島上，一般與長期轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)[19]。CpG島位于基因的啟動子區(qū)域,因此又稱5′-CpG島，與其他CpG二核苷酸不同[20]。研究發(fā)現(xiàn)，CpG位點(diǎn)甲基化可以促進(jìn)多巴胺受體D2(dopamine receptor D2,DRD2)基因表達(dá)[21]；P15基因啟動子區(qū)域5′-CpG島的異常甲基化是基因失活的主要機(jī)制[22]。因此，CpG甲基化是影響基因表達(dá)的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，在lncRNA-BMP4的啟動子區(qū)域中沒有發(fā)現(xiàn)CpG島，但是在它的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)很多CG位點(diǎn)；而添加5′-Azacd發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化水平的改變不影響lncRNA-BMP4的啟動活性。推測CG位點(diǎn)可能不足以引起STAT1轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合，從而無法影響lncRNA-BMP4的啟動活性。

3.3 組蛋白乙酰化正向調(diào)控lncRNA-BMP4 啟動子活性

組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳學(xué)研究的重要組成部分，與基因活化密切相關(guān)[23]，它能使DNA與組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)松弛，從而使各種轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子能與DNA結(jié)合位點(diǎn)特異性地結(jié)合，激活基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞核內(nèi)，組蛋白乙酰化與組蛋白去乙酰化過程處于動態(tài)平衡，并由組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同調(diào)控。HAT可將乙酰輔酶A的乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白N-末端特定的賴氨酸殘基上，HDAC可使組蛋白去乙酰化，與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，使染色質(zhì)致密卷曲，基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制[24]。研究發(fā)現(xiàn)，H3K27乙酰化可以激活lncRNA TINCR[25]、lncRNA CCAT1[26]、lncRNA CRNDE[27]啟動子活性，說明組蛋白乙酰化能調(diào)控lncRNA的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，組蛋白乙酰化確實(shí)可以激活lncRNA-BMP4的表達(dá)，而轉(zhuǎn)錄因子STAT1也能促進(jìn)lncRNA-BMP4的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，STAT1與DNA結(jié)合導(dǎo)致組蛋白乙酰化(H3ac，H4ac)[28]，STAT1也可以通過招募CBP/p300來增加組蛋白乙酰化[29]。表明STAT1的調(diào)節(jié)過程存在組蛋白乙酰化參與[30]，而在lncRNA啟動子區(qū)是何種調(diào)控模式，仍有待于后續(xù)深入研究。

4 結(jié) 論

雞lncRNA-BMP4的核心啟動區(qū)域?yàn)楱D832～―651 bp，其中轉(zhuǎn)錄因子STAT1通過順反式調(diào)控lncRNA-BMP4的啟動活性；DNA甲基化不影響lncRNA-BMP4的轉(zhuǎn)錄，而組蛋白乙酰化可激活其表達(dá)。