中國荷斯坦牛PIK3CB基因多態性及其與繁殖和產奶性狀的關聯分析

2022-09-22 05:17:12徐昊祺許靜漪胡麗蓉羅漢鵬張海亮劉巧香王雅春

中國畜牧獸醫 2022年9期

關鍵詞：關聯

徐昊祺，許靜漪，胡麗蓉，張帆，羅漢鵬，張海亮，師睿，李想，劉林，劉巧香，郭剛，王雅春

(1.中國農業大學動物科技學院，農業農村部動物遺傳育種與繁殖(家畜)重點實驗室，畜禽育種國家工程實驗室，北京 100193；2.北京奶牛中心，北京 100192；3.北京生物種業創新聯合體，北京 101206；4.北京首農畜牧發展有限公司，北京 100029)

長期以來，育種者對奶牛的產奶性能進行了高強度的選育，其遺傳進展取得了一定程度的改善[1]。然而，由于產奶性狀與繁殖性狀之間存在的不利遺傳相關，產奶性狀的高強度選擇造成了繁殖、健康、長壽等功能性狀的衰退，嚴重影響了奶牛養殖的效益[2]。由于繁殖性狀的遺傳力較低，常規選育進展速度較慢；針對繁殖性狀進行相關研究，篩選候選基因和分子標記，采用分子標記進行輔助選擇對繁殖性狀的遺傳改良具有重要意義。師睿等[3]前期對中國荷斯坦牛繁殖性狀進行了全基因組關聯分析，獲得了包含磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞單位β(PIK3CB)在內的多個候選基因。隨后，采用蛋白互作網絡分析發現PIK3CB基因與多個候選基因存在互作關系，表明PIK3CB基因可能是影響中國荷斯坦牛繁殖性狀的重要基因(未發表)。PIK3CB基因可以編碼磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號轉導通路中磷脂酰肌醇3-激酶的p110催化亞單位PI3Kp110β[4]，PI3K/Akt通路廣泛存在細胞中，對細胞周期、凋亡、糖代謝及其他重要生理過程產生調節作用[5]。

研究表明，PI3K/Akt通路可調節奶牛等哺乳動物顆粒細胞的凋亡進程，參與卵泡發育和排卵，以調控卵巢活動周期[6-7]。畜禽生殖器官的細胞凋亡與繁殖性能存在關系，在雌性動物卵巢中，卵母細胞、顆粒細胞和黃體細胞的凋亡會使卵泡閉鎖，從而影響卵巢發育[8-9]。排卵后殘留的顆粒細胞和膜細胞形成黃體，黃體的正常退化是啟動下一個發情周期和卵泡發育的重要條件，黃體的溶解也同樣與細胞凋亡有密切聯系[10]。輸卵管上皮細胞和子宮內膜細胞的周期性生長、分化、退化和再生與生殖周期有密切聯系；在不同繁殖力的母羊生殖器官中，細胞凋亡情況和細胞凋亡基因Bad的表達存在顯著差異，Bad基因編碼PI3K/Akt通路下游Bcl-2家族中的促進細胞凋亡蛋白，受上游PIK3CB基因表達的調控[11]。馬鴻程等[12]發現，在牦牛不同大小級別卵泡壁顆粒細胞及卵母細胞中均有PIK3CB基因表達，其參與了PI3K/Akt介導的卵泡發育調控。上述研究表明PIK3CB基因可能在動物繁殖生理中扮演著重要角色。此外，PI3K/Akt通路通過調控葡萄糖攝取和脂質合成，參與奶牛乳腺上皮細胞的功能分化和乳汁合成的代謝途徑[13]。葡萄糖是泌乳奶牛合成乳糖的前體物質，與乳脂、乳蛋白的合成密切相關，對泌乳奶牛具有重要的營養生理功能[14]。同時，乳糖可以維持牛奶的滲透壓，其合成速率是產奶量的主要控制因素[15]。在敲除PIK3CB基因的小鼠肝臟中，p110β的缺失會影響胰島素敏感性和葡萄糖穩態[16]。PI3K/Akt通路上游PIK3CB基因參與表達的PI3K蛋白受胰島素受體激活后催化4，5-二磷酸脂酰肌醇(PIP2)生成第二信使PIP3，可以調控糖原合成、抑制糖異生，降低血糖[17]，從而影響奶牛的產奶性能。

綜上，PIK3CB基因可能與中國荷斯坦牛繁殖和產奶性狀有關，但在荷斯坦牛中鮮見關于PIK3CB基因多態性與繁殖和產奶性狀的關聯分析。本研究擬通過篩查PIK3CB基因的單核苷酸多態位點(SNP)，并與荷斯坦牛的5個繁殖性狀(初產日齡、初配日齡、產犢至首次配種間隔、青年牛首末次配種間隔、經產牛首末次配種間隔)和6個產奶性狀(產奶量、乳蛋白量、乳蛋白率、乳脂量、乳脂率、體細胞評分)進行關聯分析，以探究該基因與荷斯坦牛繁殖和產奶性狀的關系，獲得中國荷斯坦牛繁殖和產奶相關的遺傳標記，為中國奶牛的標記輔助選擇和基因組選擇提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 DNA混池構建

選取70頭無親緣關系或親緣關系較遠的中國荷斯坦牛公牛構建DNA池，凍精樣品由北京奶牛中心提供。用高鹽法提取凍精樣品基因組DNA，使用NanoDrop 2000檢測濃度后將所有DNA稀釋到100 ng/μL，于-40 ℃保存備用。

1.2 樣品采集和DNA提取

挑選北京地區8個牛場(金銀島、半截河、南三、渠頭、長三、長四、金星和中以)1 160頭健康的泌乳荷斯坦牛，采集血液樣品，每頭牛采集尾根靜脈血約10 mL，使用血液基因組DNA提取試劑盒(DP318，天根生化科技(北京)有限公司)從抗凝血樣提取基因組DNA，利用NanoDrop 2000測定樣品DNA濃度和純度，并通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA片段完整性，―40 ℃保存備用。

1.3 基因多態性篩查

根據GenBank中牛PIK3CB基因的序列(登錄號：NC_037328.1)，采用Primer-BLAST設計引物，引物信息見表1。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應體系25 μL：DNA(100 ng/μL)1 μL，1×CataAmpTaqPlus PCR Mix(北京開拓賽思生物技術有限公司)22 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各1 μL。PCR反應程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，退火(溫度見表1)30 s，72 ℃延伸10 s，共35個循環；72 ℃延伸1 min。PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠檢測后，送至北京擎科生物科技有限公司測序，利用R語言對測序峰圖進行可視化，識別雙峰，并比對參考序列篩選SNP位點。

表1 引物信息

續表

1.4 基因分型

針對篩選出的SNP，根據其峰值比例、距離、所處區域及突變類型等確定了7個SNPs用于在1 160頭泌乳荷斯坦牛中進行基因分型。采用競爭性等位基因特異性PCR(KASP)技術進行SNP分型，其檢測引物和通用引物見表2，KASP分型由中玉金標記(北京)生物技術股份有限公司完成。

表2 多態位點競爭性等位基因特異性PCR(KASP)分型引物信息

1.5 育種值估計

本研究收集了北京地區荷斯坦牛群(與基因分型個體屬于相同群體)的初產日齡(AFC)、初配日齡(AFS)、產犢至首次配種間隔(ICF)、青年牛首末次配種間隔(IFL_H)、經產牛首末次配種間隔(IFL_C)5個繁殖性狀以及產奶量(MY)、乳蛋白量(PY)、乳蛋白率(PP)、乳脂量(FY)、乳脂率(FP)、體細胞評分(SCS)6個產奶性狀的估計育種值(EBV)作為表型，用于關聯分析。基于牛群的生產性能測定記錄和牧場管理記錄，進行上述性狀的常規遺傳評估工作，進而獲得上述性狀的估計育種值，繁殖和產奶性狀的遺傳評估模型參考Liu等[18]和任小麗等[19]的研究。

1.6 數據處理與統計分析

對7個SNPs進行分型后，統計具有多態位點的基因型頻率、基因頻率、多態信息含量(PIC)、群體雜合度(He)和有效等位基因數(Ne)，并檢驗各SNP基因型分布是否符合哈代-溫伯格平衡定律。使用Haploview 4.2軟件對PIK3CB基因SNP進行連鎖不平衡分析，并構建單倍型塊。

采用SAS 9.2軟件的GLM過程對5個繁殖性狀(AFC、AFS、ICF、IFL_H和IFL_C)和6個產奶性狀(MY、PY、PP、FY、FP和SCS)與PIK3CB基因的7個SNPs進行基于單位點和單倍型組合的關聯分析，關聯分析模型為：

Y=μ+G+e

式中,Y,泌乳牛各繁殖或產奶性狀的EBV;μ,群體均值;G,基因型或單倍型固定效應;e,隨機殘差。采用Bonferronit檢驗進行組間比較。結果以最小二乘均值±標準誤表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 PIK3CB基因的SNP

根據雙峰篩查與序列比對，確定了17個位于1號染色體上的候選SNPs位點(表3)，均已被數據庫收錄，其中15個SNPs位于內含子區域，2個SNPs位于外顯子區域。最終確定7個SNPs用于在泌乳牛群體中分型，其測序峰圖如圖3所示。由圖3可知，g.130430832 A>-位點可見由缺失導致的片段錯位，其余SNP位點可見明顯套峰。

表3 PIK3CB基因候選SNPs信息

箭頭所示為SNPs位點

2.2 SNP的群體遺傳學分析

通過KASP分型技術，本研究在1 160頭泌乳荷斯坦牛中獲得了7個SNPs的基因型，部分結果如圖3所示。由圖3可以看到3種基因型聚類明顯，說明SNP分型結果可靠。

左上和右下區域點分別代表純合基因型；中間區域點代表雜合基因型；圓圈中點代表無明確分型的信號；左下區域點為空白對照

由表4可知，PIK3CB基因7個SNPs的MAF的范圍為0.12～0.44。位點g.130430832 A>-、g.130433743 A>G和g.130448069 G>A的PIC分別為0.21、0.23和0.22，為低度多態；其余SNP的PIC位于0.41～0.49之間，為中度多態。g.130448069 G>A位點處于哈代-溫伯格不平衡狀態(P<0.05),其余SNPs均處于哈代-溫伯格平衡狀態(P>0.05)。7個SNPs的遺傳雜合度(He)較低，說明其在測定群體中變異較小。g.130430832 A>-、g.130433743 A>G和g.130448069 G>A位點的有效等位基因數(Ne)較小，等位基因在測驗群體中分布較不均勻，其余SNPs均接近于2，說明等位基因在測驗群體中分布均勻。