關(guān)中奶山羊睪丸不同發(fā)育階段代謝物的差異分析

王 廣，鄒家浩，張永濤，李德嫻，李雪清，余夢琦，陳 璐，袁宇欣，李 廣

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，奶羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100)

睪丸作為雄性性腺，具有生精和內(nèi)分泌作用，其功能障礙易造成性功能減退或不育[1]，一方面導(dǎo)致公畜繁殖力低下，生產(chǎn)效益降低；另一方面，也會引起雄性不育。影響關(guān)中奶山羊生殖功能的因素較多，布氏桿菌病、空氣污染、電離輻射、慢性炎癥、睪丸炎等均有生殖毒性，可影響關(guān)中奶山羊的生殖器官和精液品質(zhì)，最終導(dǎo)致不育，從而極大程度上制約了關(guān)中奶山羊的精準(zhǔn)繁育。近年來，隨著分子細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及其在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，包括睪丸功能在內(nèi)的雄性生殖生理研究有了長足的發(fā)展，一些以前無法確診的疾病找到了病因，雄性不育的治愈率也有所提升。但是目前睪丸功能的檢查技術(shù)主要包括形態(tài)檢查、睪丸活檢和透光試驗(yàn)等[1-2]，過程較為復(fù)雜，也缺乏相應(yīng)的生物標(biāo)志物，使其在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用受到了很大的限制。代謝組學(xué)是探究代謝物動態(tài)變化與疾病發(fā)生關(guān)系的一門新興學(xué)科，代謝物作為生化反應(yīng)的終點(diǎn)，體現(xiàn)了生物功能的最終效應(yīng)，直接指示異常的生理狀態(tài)，可作為疾病發(fā)生的標(biāo)志物[1，3]。利用代謝組學(xué)研究睪丸的生理病理特征，不僅可以促進(jìn)雄性生殖生理的研究，而且可以加快睪丸生物標(biāo)志物的篩選，有利于促進(jìn)相關(guān)疾病的診治。通過代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在睪丸支持細(xì)胞中煙堿酸、煙酰胺、肉堿、磷酸腺苷、谷氨酰胺均有顯著變化[4-5]，在不孕癥患者精液中乙酰肉堿、胞苷和尿苷水平顯著降低，溶血磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺水平顯著上升[1，6-7]。Ebrahimi等[8]采用NMR和HPLC技術(shù)對口服東革阿里后大鼠的精子數(shù)量進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在精子數(shù)量增加的大鼠尿液中檢測到較高濃度的丙氨酸和葫蘆巴堿，而乙醇濃度顯著降低，東革阿里中的苦味素通過增強(qiáng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮類固醇生成或降低乙醇含量來促進(jìn)精子發(fā)生。

睪丸的發(fā)育是一個(gè)漸進(jìn)的生理過程，睪丸是雄性畜禽最重要的生殖器官之一，其發(fā)育進(jìn)程與精子發(fā)生過程密切相關(guān)。關(guān)中奶山羊是陜西關(guān)中地區(qū)的優(yōu)良奶山羊品種，關(guān)中奶山羊一般在1月齡斷奶，在24月齡達(dá)到體成熟；1月齡曲精細(xì)管內(nèi)生殖母細(xì)胞排列疏松，精母細(xì)胞尚未形成，24月齡各級精母細(xì)胞、精子大量形成，精母細(xì)胞附于基膜。在生產(chǎn)實(shí)踐中，關(guān)中奶山羊睪丸發(fā)育不良往往產(chǎn)生少精、弱精、畸形精和無精癥狀，給關(guān)中奶山羊產(chǎn)業(yè)帶來很多不必要的損失。目前，從代謝組學(xué)角度探討關(guān)中奶山羊睪丸發(fā)育代謝機(jī)制的研究較少。鑒于此，本試驗(yàn)采用非靶向代謝組學(xué)(液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS))技術(shù)對斷奶期(1月齡)和體成熟期(24月齡)的關(guān)中奶山羊睪丸組織進(jìn)行了代謝組學(xué)比較分析，以期從代謝組學(xué)方面揭示關(guān)中奶山羊睪丸的發(fā)育機(jī)制，為今后深入探究睪丸正常生精功能的維持、繁殖障礙疾病的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選取同一養(yǎng)殖環(huán)境下1月齡(G1組)和24月齡(G24組)健康的雄性關(guān)中奶山羊共12只，每組6只，用手術(shù)去勢法分別采集睪丸組織，立即用生理鹽水洗去表面血漬，并將提取好的睪丸組織放入滅菌瓷盤中，于超凈臺下對睪丸組織進(jìn)行切割，將處理好的睪丸樣本迅速放入預(yù)冷好的、無酶的、耐―196 ℃超低溫的10 mL凍存管內(nèi)，將封裝好的睪丸樣本凍存管投入液氮速凍3 h后取出，放入―80 ℃保存?zhèn)溆茫瑢⑵渲衼碓从谙嗤挲g段的6個(gè)睪丸組織樣本，視為生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 使用天平精確稱取30 mg組織樣品放入1.5 mL EP管內(nèi)，加入20 μL內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配制)，加入400 μL甲醇-水溶液(CH3OH∶H2O=4∶1，V/V)，加入2個(gè)小鋼珠，―20 ℃預(yù)冷2 min后，放入研磨機(jī)中研磨(60 Hz，2 min)；冰水浴超聲萃取10 min，―20 ℃靜置10 min；4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取300 μL上清液裝入LC-MS進(jìn)樣小瓶中揮干；用300 μL甲醇-水溶液(CH3OH∶H2O=1∶4，V/V)復(fù)溶(渦旋30 s，超聲3 min)；―20 ℃靜置約2 h；4 ℃、13 000 r/min離心10 min，用注射器抽取150 μL上清液，通過0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾器過濾后，移送到LC進(jìn)樣小瓶，完成LC-MS分析；質(zhì)控樣本(QC)由每個(gè)樣品的提取液等體積混合后配制而成，每個(gè)QC的總體積與樣品大小一致，且每個(gè)提取試劑使用前均在―20 ℃進(jìn)行預(yù)冷。

1.2.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采集 本研究使用由Dioex U3000與UHPLC超高效液相串聯(lián)QE plus超高液相質(zhì)譜儀所構(gòu)成的液質(zhì)聯(lián)用體系，并配備了加熱電噴霧離子源ESI(賽默飛世爾科技公司)，樣品質(zhì)譜信息收集部分使用ESI正負(fù)離子掃描模式。色譜柱條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫為45 ℃，流速為0.35 mL/min，進(jìn)樣容積2 μL，流動相A為水(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈(含0.1%甲酸)。通過梯度式洗脫程序?qū)崿F(xiàn)分離：5% B 0.01 min；5% B 2 min；30% B 4 min；50% B 8 min；80% B 10 min；100% B 14 min；100% B 15 min；5% B 15.1 min；5% B 16 min。全部樣品分析過程中保持在4 ℃，質(zhì)量范圍在100～1 000質(zhì)荷比(m/z)。全譜掃描的分辨率為70 000，HCD質(zhì)譜/質(zhì)譜掃描的分辨率為17 500，瀏覽碰撞能量分別設(shè)為10、20和40 eV。

質(zhì)譜儀的工作方式為：噴霧電壓為3 800 V(+)和3 200 V(-)，護(hù)套氣流量，任意40個(gè)裝置；輔助氣流量，任意8個(gè)單元；毛細(xì)血管溫度為320 ℃；探針加熱器溫度為350 ℃；S-透鏡射頻電平為50 Ω。在整個(gè)分析過程中，定期為每個(gè)樣本注射QC，為每個(gè)樣本提供一組數(shù)據(jù)，從而可以評估可重復(fù)性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

原始LC-MS數(shù)據(jù)由Progenesis QI v 2.3軟件處理(紐卡斯?fàn)柗蔷€性動力學(xué)公司)，用于基線濾波、峰值識別、積分函數(shù)、保留時(shí)間校準(zhǔn)、峰值校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化。主要參數(shù)為：5 ppm前體耐受性、10 ppm產(chǎn)物耐受性和5%產(chǎn)物離子閾值。化合物鑒定采用了精確的質(zhì)荷比、二級片段和同位素分布，使用人代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)、Lipidmaps v 2.3、Metlin、EMDB、PMDB和自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性分析。通過去除組中50%的缺失值(離子強(qiáng)度=0)的任何峰，將零值替換為最小值的1/2，并通過對化合物的定量分析結(jié)果進(jìn)行檢測，以進(jìn)一步處理提取的數(shù)據(jù)，結(jié)果總分低于36分(滿分60分)的化合物也被視為不準(zhǔn)確并被刪除。數(shù)據(jù)矩陣由正、負(fù)離子數(shù)據(jù)組合而成。

將所得數(shù)據(jù)矩陣輸入SIMCA 14.0軟件系統(tǒng)(Umetrics AB公司)完成模式識別，先使用無監(jiān)督的主成分分析(PCA)來研究各樣品中間的總體布局和整體解析流程的運(yùn)動穩(wěn)定性，再使用有監(jiān)督的偏最小二乘法分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)來區(qū)分各組所有中間代謝結(jié)構(gòu)輪廓的總體差異性，從而發(fā)現(xiàn)2組的差異代謝物。根據(jù)Fiehn數(shù)據(jù)庫對代謝物進(jìn)行分配，并計(jì)算2組差異代謝物的FoldChange值，經(jīng)過log2轉(zhuǎn)換后，log2FoldChange>0表示上調(diào)，log2FoldChange<0表示下調(diào)；通過-log10P-value計(jì)算自由差異代謝物的原始P值，-log100.05=1.30，-log10P-value>1.30為顯著性差異，-log10P-value<1.30為無顯著性差異。試驗(yàn)通過多維和單維分析方法相結(jié)合的方式來檢測區(qū)域間的不同代謝物，利用Pearson相關(guān)系數(shù)衡量不同代謝物間的線性相關(guān)程度，并對差異代謝物進(jìn)行通路富集分析，檢測準(zhǔn)則為：OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1，t檢驗(yàn)的P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 多元統(tǒng)計(jì)分析

表1 G1和G24組間多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

A，PCA得分圖；B，PLS-DA得分圖；C，OPLS-DA得分圖；D，響應(yīng)排序檢驗(yàn)圖

2.2 單變量統(tǒng)計(jì)分析

由圖2可知，右邊矩形區(qū)域的點(diǎn)表示代謝物表達(dá)上調(diào)，左邊矩形區(qū)域的點(diǎn)表示代謝物表達(dá)下調(diào)，下方矩形區(qū)域的點(diǎn)表示代謝物表達(dá)沒有顯著性差異，在1(G1)和24(G24)月齡關(guān)中奶山羊睪丸組織中共篩選出334個(gè)差異代謝物，其中137個(gè)顯著上調(diào)，197個(gè)顯著下調(diào)(圖3)。

圖2 所有代謝物的火山圖

圖3 所有代謝物的層次聚類分析熱圖

2.3 差異代謝物的篩選與鑒定

通過OSI/SMMS結(jié)合HMDB、Lipidmaps和Metlin三大數(shù)據(jù)庫來確定差異代謝物，通過差異代謝物熱圖、VIP及P值篩選差異代謝物火山圖，選出前36個(gè)差異代謝物，G1和G24組差異代謝物主類包括21個(gè)脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子、6個(gè)有機(jī)酸及其衍生物、6個(gè)未分類的衍生物、3個(gè)苯丙烷和聚酮化合物。其中，脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子包括16個(gè)甘油磷脂、2個(gè)鞘脂、2個(gè)脂肪酰基、1個(gè)聚酮化合物；有機(jī)酸及其衍生物包括4個(gè)羧基及其衍生物、1個(gè)有機(jī)雜環(huán)化合物、1個(gè)有機(jī)氮化合物；未分類的衍生物包括6個(gè)無類別的化合物；苯丙烷和聚酮化合物包括1個(gè)3,4-二氫香豆素、2個(gè)肉桂酸及其衍生物(表2)。

表2 G1和G24組前36種顯著差異代謝物

續(xù)表

2.4 差異代謝物的相關(guān)性分析

利用Pearson相關(guān)系數(shù)可以衡量2個(gè)代謝物之間的線性相關(guān)程度，根據(jù)VIP值大小選取前50個(gè)差異代謝物進(jìn)行可視化分析1和24月齡關(guān)中奶山羊睪丸代謝物之間的相關(guān)性，范圍為―1.0(最大負(fù)相關(guān))～1.0(最大正相關(guān))，0表示沒有相關(guān)性。由圖4可知，在1和24月齡關(guān)中奶山羊睪丸發(fā)育過程中，脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子與甘油磷脂呈最大正相關(guān)，羧基及其衍生物與甘油磷脂呈最大負(fù)相關(guān)。

矩形外，正相關(guān)；矩形內(nèi)，負(fù)相關(guān)；不同大小的圓圈表示Pearson系數(shù)的相關(guān)性

2.5 代謝通路的富集分析

通過對前20個(gè)差異代謝物的KEGG ID與代謝物生物學(xué)(MBROLE)途徑分析，富集了睪丸組織發(fā)育代謝過程中潛在的差異代謝通路。由圖5可知，-log10P-value>1.5的代謝通路是試驗(yàn)中最關(guān)鍵的通路，在這些代謝途徑中，生物模塊參與的極顯著代謝通路有7條，分別為腫瘤中的膽堿代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、腫瘤中的中心碳代謝、精氨酸生物合成、鐵死亡、GABA能突觸和蛋白質(zhì)消化吸收(P<0.01)；生物模塊參與的顯著代謝通路有11條，分別為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、近端小管碳酸氫鹽再生、氨酰-tRNA生物合成、甘油磷脂代謝、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、牛磺酸和亞牛磺酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、mTOR信號通路和細(xì)胞凋亡(P<0.05)。

圖5 前20條代謝通路富集圖

經(jīng)差異代謝物富集分析，從1和24月齡關(guān)中奶山羊睪丸發(fā)育代謝通路發(fā)現(xiàn)7條關(guān)鍵通路，分別為腫瘤中的膽堿代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、腫瘤中的中心碳代謝、鐵死亡、谷胱甘肽代謝、氨酰-tRNA生物合成、牛磺酸和亞牛磺酸代謝(表3)。

表3 G1和G24組睪丸發(fā)育代謝的潛在通路

3 討 論

睪丸的生長發(fā)育和功能完善受到體內(nèi)外許多重要因素的影響，如哺乳動物的遺傳特點(diǎn)、飼養(yǎng)管理方式、營養(yǎng)水平和內(nèi)分泌代謝方式等，而這些因素的改變通常都會通過作用于機(jī)體的重要基因而起到生物學(xué)作用[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，睪丸生長發(fā)育成熟、功能完善前后的代謝物有顯著變化。基因組組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別是從基因和蛋白質(zhì)層面探尋生命的活動，而實(shí)際上細(xì)胞內(nèi)許多生命活動是發(fā)生在代謝物層面的[11]，如細(xì)胞信號釋放、能量的傳導(dǎo)、細(xì)胞間通信等都是受代謝物控制的。代謝組學(xué)是繼基因組研究和蛋白質(zhì)組學(xué)后新發(fā)展起來的又一個(gè)學(xué)科，是系統(tǒng)生理學(xué)的主要部分，之后得以快速發(fā)展和滲入許多應(yīng)用領(lǐng)域，如動物健康及其發(fā)育機(jī)理等。代謝組學(xué)中最常見的分析方法還有核磁共振光譜(NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和LC-MS[12-13]。通常GC-MS用于分析小分子質(zhì)量的揮發(fā)性化合物，而LC-MS用于分析小分子質(zhì)量的非揮發(fā)性化合物[14]。目前，LC-MS技術(shù)已是生物代謝組學(xué)分析中比較完善的技術(shù)手段之一，其對樣本前處理也較為簡單，且檢測到的代謝物多為有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸及某些脂類[15-16]。近年來，對睪丸的研究重點(diǎn)集中在小鼠、豬、牦牛和人的睪丸基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組分上[17-24]，但目前在關(guān)中奶山羊睪丸代謝組層面其發(fā)育機(jī)理尚不明確。

本試驗(yàn)分析了1和24月齡關(guān)中奶山羊睪丸生長發(fā)育過程中差異代謝物的變化，共鑒定出334個(gè)差異代謝物，組間差異均有生物學(xué)意義，其中顯著上調(diào)137個(gè)，顯著下調(diào)197個(gè)；進(jìn)一步篩選出前36個(gè)顯著差異代謝物，分別為脂質(zhì)和類脂質(zhì)、有機(jī)酸及其衍生物、未分類的化合物、苯丙烷和聚酮化合物四大類。其中，脂質(zhì)和類脂質(zhì)變量的權(quán)重?cái)?shù)值最大，主要參與細(xì)胞外生長過程和分子物質(zhì)信息的傳遞功能，脂質(zhì)和類脂質(zhì)缺失也會引起細(xì)胞膜受損，而磷脂中所含的乙酰基團(tuán)深入到中樞神經(jīng)細(xì)胞間隙與膽堿相互作用，從而產(chǎn)生乙酰膽堿，乙酰膽堿也是向各類中樞神經(jīng)細(xì)胞間傳送信息的重要分子物質(zhì)[25]，而有機(jī)酸及其衍生物則有著促進(jìn)細(xì)胞生長發(fā)育的重要作用，苯丙烷的表達(dá)水平和功能直接關(guān)系到動物的免疫能力和生長發(fā)育的平衡，聚酮化合物則利用多級或級聯(lián)式傳遞程序引發(fā)細(xì)胞的生長發(fā)育、繁殖、分裂、凋亡等生物學(xué)過程，并同時(shí)參與炎癥、腫瘤等病理過程[26]，此外，它還與RAS、PI3K、Akt等生物學(xué)信號系統(tǒng)有著廣泛聯(lián)系。

本研究中，在1和24月齡關(guān)中奶山羊睪丸發(fā)育過程中，脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子與甘油磷脂呈最大正相關(guān)，羧基及其衍生物與甘油磷脂呈最大負(fù)相關(guān)，表明脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子在睪丸發(fā)育過程中具有促進(jìn)作用，羧基及其衍生物具有一定的頡頏和平衡作用，脂質(zhì)和類脂質(zhì)、有機(jī)酸及其衍生物、苯丙烷和聚酮化合物均能影響睪丸組織的免疫能力和生長發(fā)育的代謝。本試驗(yàn)富集到7條潛在的關(guān)鍵代謝通路，涉及氧化應(yīng)激、能量代謝、細(xì)胞凋亡三大塊，分別為腫瘤中的膽堿代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、腫瘤中的中心碳代謝、鐵死亡、谷胱甘肽代謝、氨酰-tRNA生物、牛磺酸和亞牛磺酸代謝。曾婷等[27]研究指出，谷胱甘肽代謝、脂質(zhì)代謝和鐵代謝都與鐵死亡的發(fā)生密切相關(guān)。在本試驗(yàn)關(guān)中奶山羊睪丸發(fā)育代謝過程中，谷胱甘肽代謝通路和鐵死亡通路的發(fā)生也同時(shí)存在，與前人研究結(jié)果一致。Hara等[28]研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸和脯氨酸代謝過程中ArgⅡ酶表達(dá)量很少，主要在哺乳動物外周組織(包括神經(jīng)元、腎臟、血管和肌肉細(xì)胞)中表達(dá)為線粒體蛋白，對一氧化氮、脯氨酸和多胺的合成具有重要的調(diào)控作用[29]。本試驗(yàn)中，精氨酸和脯氨酸代謝發(fā)生在睪丸組織代謝過程中，且精氨酸和脯氨酸代謝通路極顯著，說明精氨酸對脯氨酸的合成有一定的調(diào)控作用。因此，在1～24月齡關(guān)中奶山羊發(fā)育代謝過程中，這7條潛在的代謝通路可為后續(xù)研究哺乳動物睪丸、精子的發(fā)育及治療雄性繁殖障礙疾病提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究共篩選出334個(gè)差異代謝物，其中顯著上調(diào)137個(gè)，顯著下調(diào)197個(gè)；并篩選出前36種顯著差異代謝物，分別為脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子、有機(jī)酸及其衍生物、未分類化合物、苯丙烷和聚酮化合物四大類。對不同代謝物進(jìn)行富集分析得到7條關(guān)鍵代謝通路，可能是睪丸發(fā)育過程的潛在代謝通路。