熱補針法對類風濕關節炎寒證模型兔膝關節滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT表達的影響

袁博，張楓帆，張星華，姚小強，井維堯，杜小正

1.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以侵犯小關節為主的免疫系統疾病，常呈對稱侵襲，主要涉及關節滑膜、關節軟骨損傷，并伴有皮膚、血管和內臟器官損害。數據顯示，全球約1%人口患RA，發病率高，疾病后期出現關節畸形、功能喪失，嚴重損害患者的身心健康與生存質量。RA發病機制尚未完全闡明。研究顯示，氧化應激在RA發生發展中發揮重要作用，沉默信息調節因子3（SIRT3）通過介導活性氧（ROS）清除參與RA發病。SIRT3與超氧化物歧化酶（SOD）2和過氧化氫酶（CAT）等ROS清除酶的活性及表達關系密切，調控SIRT3的表達能調節ROS清除酶的活性，從而發揮抗氧化作用。熱補針法是鄭魁山教授臨床治療RA的經驗法，具有補益正氣、溫陽散寒作用，由“燒山火”“進火法”簡化改良而成，臨床治療陽虛致寒痹證療效較好。課題組前期研究表明，熱補針法對RA模型兔具有相對特異性干預作用。基于此，本研究以RA寒證模型兔為研究對象，觀察熱補針法對兔膝關節滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT表達的影響，進一步探討其干預RA的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

30只健康普通級雄性新西蘭兔，2～3月齡，體質量（2.5±0.5）kg，購于蘭州大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（甘）2013-0002。飼養于溫度（20±2）℃、相對濕度（50±10）%環境，室內采光、通風均良好，適應性飼養7 d。

1.2 主要試劑與儀器

DEPC水（貨號7732-185，德國Sigma公司），弗氏完全佐劑（FCA，貨號F5881，德國Sigma公司），卵蛋白干粉（貨號A5253-250G，德Sigma公司），TRIeasyTotal RNA Extraction Reagent（貨 號T0817211，上海翌圣生物），HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（貨號T081721，上海翌圣生物），HieffqPCR SYBR Green Master Mix（貨號10606ES60，上海翌圣生物）。華成牌一次性針灸針（0.22 mm×25 mm，北京珞亞山川醫療器械有限公司），熱刺痛儀（型號PL-200，成都泰盟軟件有限公司），彩色超聲診斷儀（型號8～12 MHz，德國百盛公司），超微量分光光度計（型號NanoDrop One，美國Thermo公司），實時定量PCR儀（型號StepOne Plus，美國Agilent公司）。

1.3 造模及分組

30只兔采用隨機數字表法選取6只作為正常組，剩余24只采用卵蛋白誘導聯合低溫冷凍法復制RA寒證模型。實驗前3 d，剪去肩胛區兔毛，于肩背部均勻選取6個點，2%碘酒、75%酒精消毒，每點注射0.2 mL乳化劑（4 mg/mL卵蛋白溶液與等量FCA混合，充分震蕩）。14 d后以相同方式、相同劑量重復皮下注射1次。6 d后清理兔雙側后腿膝關節體毛，用2%碘酒、75%酒精消毒，定位膝關節腔，注入20 mg/mL卵蛋白生理鹽水溶液0.4 mL，24 h內膝關節即出現紅腫觸痛。造模后第2日，2%碘酒、75%酒精消毒后腿膝關節，四周予冷凍處理，采用冰袋圍置冷凍1.5 h、45℃溫水復溫5 min，每日1次，共14 d。造模兔出現精神萎靡，身體蜷縮，膝關節腫脹、局部青紫、周徑明顯變大、皮溫不高，兩后肢匍匐跛行，觸之有躲避行為，表示成功建立RA寒證模型。將24只成模兔隨機分為模型組、平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組，每組6只。

1.4 干預

正常組、模型組不予干預，只做與各針刺組相同的抓取、固定；各針刺組將兔固定，2%碘酒、75%酒精消毒，毫針90°（深度8～12 mm）直刺雙側“足三里”。平補平瀉組：予平補平瀉法針刺。針刺得氣后，前后均勻捻轉針體，防止單向捻轉，指力均勻適中，角度控制在180°～360°，頻率60～90 r/min。捻轉補法組：予捻轉補法針刺。針刺得氣后，小幅度前后捻轉針體，角度控制在180°～360°，頻率60～90 r/min，拇指向前轉動時用力重，指力沉重向下，拇指向后還原轉動時用力輕。熱補針法組：予熱補針法針刺。針刺得氣后，左手加重壓力，右手拇指向前連續捻按5次，針下沉緊后針尖拉著有感應的部位，連續重插輕提5次，拇指再向前連續捻按5次。各針刺組行針1 min，留針30 min，每日1次，連續7 d。各針刺組手法操作均統一培訓，并由同一人完成。

1.5 檢測指標

1.5.1 一般觀察

觀察兔精神狀態、飲食飲水、反應能力、活動情況及關節腫脹情況等。

1.5.2 痛閾檢測

針刺結束后，采用PL-200熱刺痛儀刺激兔膝關節測痛點，從刺激開始到兔出現掙扎躲避所用時間即為痛閾，共測量3次，取平均值。

1.5.3 彩超觀察

使用線陣探頭為8～12 MHz的彩色多普勒超聲診斷儀檢查兔膝關節，針對膝關節腔附近多角度采集圖像，觀察膝關節腔積液、滑膜厚度及血流信號。

1.5.4 HE染色

采用空氣栓塞法處死兔，完整剝離膝關節滑膜組織，置于10%福爾馬林溶液中固定，從固定液中取出滑膜組織（厚約0.5 cm），石蠟包埋，切片（約5 μm），常規HE染色。鏡下觀察滑膜被覆細胞、炎性細胞、滑膜基質等情況。

1.5.5 RT-PCR檢測

提取膝關節滑膜組織總RNA，室溫放置10 min，根據沉淀量加入適量DEPC水，超微量分光光度計測定RNA濃度及純度，將RNA反轉錄為cDNA，進行PCR。反應條件：25℃、5 min，42℃、30 min，85℃、5 min，85℃、5 min，1個循環；95℃預變性5 min，1個循環；95℃變性10 s，60℃退火30 s，40個循環；60～95℃緩慢加溫。建立熔解曲線。根據目的基因與內參基因Ct值，并用內參進行標準化處理，依據2法對mRNA表達進行相對定量分析。SIRT3、SOD2、CAT及內參rab-actb引物由寶生物工程（大連）有限公司設計合成（見表1）。

表1 各基因PCR引物序列

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 一般狀況

正常組兔精神狀態良好，模型組兔精神萎靡，體毛雜亂，膝關節腫脹，觸之掙扎躲避，活動量減少，飲食減少，各針刺組兔精神狀態較模型有所好轉，飲食增加，關節腫脹度減輕，熱補針法組改善更明顯。

2.2 熱補針法對模型兔關節痛閾的影響

與正常組比較，模型組兔痛閾明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，各針刺組兔痛閾明顯升高（＜0.05）；與平補平瀉組、捻轉補法組比較，熱補針法組兔痛閾明顯升高（＜0.05）。見圖1。

圖1 各組兔膝關節痛閾比較（±s，每組6只）

2.3 熱補針法對模型兔膝關節彩超結果的影響

正常組兔膝關節滑膜厚度無異常，滑膜內未見異常血流信號，無積液；模型組兔膝關節滑膜增厚明顯，滑膜內呈網狀及樹枝狀血流信號，有大量積液，范圍廣泛，可見關節腫脹；平補平瀉組、捻轉補法組兔膝關節滑膜略增厚，滑膜內血流信號呈點狀或點線狀，積液減少，關節腫脹減輕；熱補針法組兔膝關節滑膜增厚不明顯，滑膜內有少量點狀血流信號，微量積液或無積液。見圖2。

圖2 各組兔膝關節彩超表現

2.4 熱補針法對模型兔膝關節滑膜組織病理形態的影響

正常組兔膝關節滑膜被覆細胞排列整齊，滑膜基質未見異常，無炎性細胞浸潤；模型組兔膝關節滑膜被覆細胞腫大明顯、排列紊亂，滑膜基質重度增生，炎性細胞重度浸潤；各針刺組兔膝關節滑膜被覆細胞情況、滑膜基質狀態、炎性細胞浸潤均有改善，熱補針法組效果最明顯。見圖3。

圖3 各組兔膝關節滑膜組織形態（HE染色，×100）

2.5 熱補針法對模型兔膝關節滑膜組織沉默信息調節因子3、超氧化物歧化酶2和過氧化氫酶mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組兔膝關節滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達明顯升高（＜0.05）；與模型組比較，平補平瀉組、捻轉補法組和熱補針法組兔膝關節滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達明顯降低（＜0.05）；與平補平瀉組、捻轉補法組比較，熱補針法組兔膝關節滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達明顯降低（＜0.05）。見表2。

表2 各組兔膝關節滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達比較（±s）

3 討論

RA主要表現為關節腫痛，慢性疼痛影響患者生活質量，是臨床治療亟需解決的問題。本實驗結果表明，各針刺組痛閾較模型組明顯升高（＜0.05），證實針刺具有明顯的鎮痛效應，其中熱補針法組痛閾升高更明顯（＜0.05），提示熱補針法鎮痛作用具有相對特異性，與課題組前期研究結果一致。

彩色多普勒超聲及病理形態觀察對RA早期診斷和檢測意義重大。在RA發病中，滑膜厚度與異常血流信號關系密切。本實驗彩超觀察結果顯示，各針刺組滑膜厚度、積液、異常血流信號、滑膜被覆細胞情況、滑膜基質狀態、炎癥細胞浸潤均明顯改善，熱補針法組改善更明顯，證實熱補針法可減輕RA兔膝關節滑膜厚度，改善異常血流信號及炎性細胞浸潤，發揮其相對特異性抗炎作用。

針灸治療RA療效顯著。平補平瀉是臨床應用最普遍的手法，捻轉補法具有溫補之功，符合針灸臨床虛證用針刺補法的規律，因此選擇二者作對照研究。熱補針法功效與RA寒證病因病機特點相吻合。課題組前期研究顯示，熱補針法對RA模型兔具有治療作用，可相對特異性發揮鎮痛作用及調節能量代謝障礙。此外，針刺通過提高抗氧化酶活性，發揮抗氧化應激作用。熱補針法能提高RA患者血漿谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶水平，降低丙二醛水平，提示熱補針法具有抗氧化應激作用。SIRT3是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，主要通過提高抗氧化酶活性，增強線粒體內ROS清除作用，發揮抗氧化應激作用。研究顯示，SIRT3能通過其去乙酰化活性作用于病理過程的關鍵靶點和蛋白，對細胞內ATP產生影響，調節氧化代謝。SODs是抗氧化系統中最重要也是最原始的抗氧化酶，當SIRT3過表達時可上調SOD2和CAT表達。本實驗結果顯示，各針刺組兔膝關節滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT mRNA表達均明顯降低（0.05），熱補針法組降低更明顯（＜0.05），SIRT3、CAT、SOD2 mRNA水平變化反映RA模型兔體內的氧化應激水平，證實熱補針法可增強RA模型兔抗氧化能力，改善機體氧化應激水平。

綜上所述，熱補針法能改善RA寒證模型兔一般狀況，提高痛閾，減輕膝關節滑膜厚度，改善異常血流信號及炎性細胞浸潤，下調膝關節滑膜組織SIRT3、SOD2、CAT表達，提示熱補針法干預RA的相對特異性與調控氧化應激反應有關。