響應面法優化超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗多糖工藝

白冰瑤，李泉岑，馬欣悅，吳一凡，喬婉怡，王馥葉，張春蘭*

（1.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

紅棗（Ziziphus jujuba Mill.）是鼠李科棗屬植物，在我國新疆、陜西、山西、河北等北方地區大量種植[1]。紅棗可用于日常直接食用或泡酒、熬粥，在食品工業中一般用于紅棗飲品的制作，在烘焙類食品中也會添加紅棗[2]。紅棗中富含多糖[3]、皂苷、維生素、多酚[4]、脂肪酸[5]等營養物質，其中紅棗多糖是紅棗最重要的活性成分之一[6]。紅棗多糖具有治療糖尿病、抗炎[7]、增強免疫力、抗癌[8]、抗過敏[9]、抗腫瘤活性[10]等生理功能，同時還表現出較好的抗氧化能力。

食品加工過程中，紅棗多糖的損失成為需要解決的重要問題。目前在食品工業中提取多糖的方法大多為傳統溶劑提取或高溫水提法提取。超聲輔助提取多糖最為普遍，此法具有耗時短、操作簡單、提取率高的優點[11-14]，而高溫水提法由于耗時長、藥品用量高且提取率低[15]，已經不能滿足市場需要。低共熔溶劑是綠色溶劑，其污染小、藥品易獲得、毒性小、價格低廉且與其他有機溶劑相比，有更高的溶解性和擴散性[16-19]，因此采用超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗多糖符合日后食品工業發展需求。在研究多糖提取過程中，由于不同低共熔溶劑體系的黏稠度及擴散性和對不同品種多糖的溶解能力不同[20-22]，因此需要對低共熔溶劑體系進行探究。本文以新疆阿克蘇紅棗作為研究對象，選用超聲輔助低共熔溶劑，通過研究不同低共熔溶劑體系、超聲溫度、超聲時間、料液比以及含水率對紅棗多糖提取效果影響的規律，確定最優的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿克蘇紅棗：市售。

無水乙醇（分析純）：天津北聯精細化工有限公司；硫酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；苯酚（分析純）：西隴科學股份有限公司；葡萄糖（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；尿素（分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；檸檬酸（分析純）：天津市化學試劑三廠；氯化膽堿、乳酸、1，4-丁二醇、脯氨酸、蘋果酸（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平（LE203E/02）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超級恒溫水浴鍋（HH-501）：江蘇金怡儀器科技有限公司；超聲清洗機（JP-060S）：深圳市潔盟清洗設備有限公司；真空泵（SHZ-DⅢ）：鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉蒸發儀（RE-3000A）：上海亞榮生化儀器廠；高速臺式離心機（TGL-20B）：上海安亭科學儀器廠；渦旋混勻器（VM-02U）：美國精騏有限公司；分光光度計（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

紅棗清洗、去核和切片，放入60℃烘箱烘干，烘干后用粉碎機粉碎，過80目篩制備紅棗粉。

1.3.2 低共熔溶劑的制備

按照司悅悅[23]的方法，將氯化膽堿分別與乳酸、1，4-丁二醇、尿素、檸檬酸、脯氨酸和蘋果酸按比例混合，在85℃條件下水浴攪拌至形成清澈透明的溶液。

1.3.3 總多糖提取工藝以及低共熔溶劑體系的確定

按照倪玉嬌等[24]的方法并加以改進，稱取1.00 g紅棗粉于離心管中，按照料液比1∶20（g/mL），含水率為20%加入低共熔溶劑16 mL，蒸餾水4 mL混合均勻，40℃超聲30 min，4 000 r/min條件下離心20 min，取上清液，加入4倍體積無水乙醇于4℃環境中醇沉過夜，4 000 r/min離心20 min收集沉淀，用無水乙醇洗滌沉淀3次后，繼續4 000 r/min離心10 min收集沉淀，沉淀物加水溶解定容至100 mL，測量其多糖提取率。低共熔溶劑的種類及比例見表1。

表1 低共熔溶劑的種類及比例Table 1 Types and proportions of low eutectic solvents

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 超聲溫度對紅棗多糖提取率的影響

在超聲時間 30 min，料液比 1∶20（g/mL），含水量20%的條件下，探究超聲溫度分別為20、30、40、50、60℃對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.2 超聲時間對紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度 40 ℃，料液比 1∶20（g/mL），含水量20%的條件下，探究超聲時間分別為10、20、30、40、50 min對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.3 料液比對紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度40℃，超聲時間為30 min，含水量20%的條件下，探究料液比分別為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30（g/mL）對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.4.4 含水量對紅棗多糖提取率的影響

在超聲溫度40℃，超聲時間為30 min，料液比為1∶10（g/mL）的條件下，探究含水量分別為 5%、10%、20%、30%、40%對紅棗多糖提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，選取超聲溫度、超聲時間、料液比、含水量4個因素，紅棗中的多糖提取率為響應值，進行Box-Behnken響應面試驗設計，紅棗多糖提取率響應面試驗因素水平見表2。

表2 紅棗多糖提取率響應面試驗因素水平Table 2 Response surface experimental factor level of extraction rate of jujube polysaccharide

1.3.6 多糖提取率的計算

1.3.6.1 葡萄糖標準曲線的制定

根據郭毓菲等[25]的方法，采用苯酚-硫酸法測定多糖提取率，將葡萄糖放置于105℃烘箱中烘至恒重后，準確稱取50 mg，配制成1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別吸取不同體積1 mg/mL的標準溶液配置成為0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.250、0.500 mg/mL 的標準溶液，分別吸取1 mL標準溶液，加入1 mL 6%苯酚和5 mL濃硫酸，渦旋混勻，90℃煮沸20 min后，于490 nm處測量其吸光值。得線性回歸方程為y=9.851 5x-0.018 4，R2=0.998 2，x為葡萄糖濃度，mg/mL；y 為對應吸光值，根據回歸方程確定紅棗中多糖濃度。

1.3.6.2 多糖提取率的測定方法及計算

吸取紅棗粗多糖溶液1mL，稀釋到一定體積。在稀釋后的溶液中吸取1mL，加入1mL6%苯酚和5mL濃硫酸，使用渦旋混勻器進行渦旋，避光保存20min后，于490 nm處測量其吸光值。多糖提取率計算公式如下。

式中：C為回歸方程計算得到紅棗多糖的濃度，mg/mL；V為定容的體積，mL；N為稀釋的倍數；M為原材料的質量，g。

1.4 數據統計

試驗所有數據測定3次，繪圖采用origin 2019b軟件，響應面分析軟件為Design-Expert 8.0.6，采用IBM SPSS Statistics26進行顯著性分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 最優低共熔溶劑體系的確定

低共熔溶劑種類對紅棗多糖提取率的影響見圖1。

圖1 低共熔溶劑種類對紅棗多糖提取率的影響Fig.1 Effect types of deep eutectic solvents on extraction rate of jujube polysaccharide

由圖1可知，不同低共熔溶劑體系中黏稠度、擴散性、電極性以及對多糖的氫鍵作用力不同，導致能溶解到低共熔溶劑中的紅棗多糖提取率不同[26]。通過比較不同低共熔溶劑種類和比例發現，控制其他條件不變，當氯化膽堿與尿素摩爾比為1∶2時，從紅棗粉中提取的多糖提取率最高，可能是氯化膽堿與尿素的混合體系黏稠度較低和擴散性較強，使多糖溶解率升高。因此，確定摩爾比1∶2的氯化膽堿與尿素為提取紅棗多糖的低共熔溶劑體系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲溫度對紅棗多糖提取率的影響

超聲溫度對紅棗多糖提取率影響結果見圖2。

圖2 超聲溫度對紅棗多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of jujube polysaccharide

紅棗多糖提取率隨著超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，并在40℃時多糖提取率最高。這是因為在未達到峰值時，溫度升高，使其多糖溶解速度加快；當溫度高于40℃后，隨著溫度繼續增大可能會有其他物質析出，導致溶液中的黏稠度增加，抑制多糖的溶解，導致多糖提取率降低[27]。因此，紅棗多糖最優提取溫度為40℃。

2.2.2 超聲時間對紅棗多糖提取率的影響

超聲時間對紅棗多糖提取率的影響結果見圖3。

圖3 超聲時間對紅棗多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction rate of jujube polysaccharide

由圖3可知，紅棗多糖提取率隨著超聲時間的增加呈先上升后下降的趨勢，并在30 min時到達峰值。這主要是由于在30 min之前紅棗多糖未能被溶劑充分溶解，導致多糖提取率較低；30 min后，由于過度超聲可能引起部分多糖降解，糖苷鍵發生斷裂，細胞破碎，結構破壞，引起多糖提取率減少[28]。因此，紅棗多糖提取的最優超聲時間為30 min。

2.2.3 料液比對紅棗多糖提取率的影響

料液比對紅棗多糖提取率的影響結果見圖4。

圖4 料液比對紅棗多糖提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of jujube polysaccharide

如圖4所示，隨著溶劑用量的不斷增加，紅棗多糖提取率先上升后下降，在料液比為1∶10（g/mL）時取得最大值，且料液比在 1∶5（g/mL）～1∶20（g/mL）時紅棗多糖提取率變化較小。原因是溶劑用量較小時低共熔溶劑體系達到飽和，無法溶解更多的紅棗多糖；當溶劑用量較大時紅棗粉與溶劑體系的接觸面積不斷增大，溶解出其他雜質，導致多糖溶解被抑制[29]。因此，選擇1∶10（g/mL）為多糖提取的最優料液比。

2.2.4 含水量對紅棗多糖提取率的影響

含水量對紅棗多糖提取率的影響結果見圖5。

圖5 含水量對紅棗多糖提取率的影響Fig.5 Effect of water content on extraction rate of jujube polysaccharide

如圖5所示，紅棗多糖提取率隨著含水量增大呈現先升高后降低的趨勢，在含水量為20%時達到最大值。原因可能是含水量太低時，溶液體系太黏稠，導致多糖無法充分析出[30]；當含水量大于20%后，可能因為含水率太高，使溶液體系中出現了其他的親水混合物，導致低共熔溶劑與多糖之間的作用力下降，引發多糖提取率減少[31]。因此，紅棗多糖提取工藝的最優含水量確定為20%。

2.3 響應面優化提取紅棗多糖工藝

2.3.1 響應面試驗設計及結果

以紅棗多糖提取率為評價指標，設計四因素三水平分析試驗，試驗設計和結果見表3。

表3 紅棗多糖提取率響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface design and results of jujube polysaccharide extraction rate

續表3 紅棗多糖提取率響應面試驗設計及結果Continue table 3 Response surface design and results of jujube polysaccharide extraction rate

2.3.2 回歸模型顯著性檢驗及方差分析

通過回歸分析，得出紅棗多糖提取率的回歸方程：紅棗多糖提取率=8.14-0.30A+0.41B-0.16C+0.60D-0.11AB-0.68AC-0.54AD+0.23BC-0.47BD-0.025CD-2.48A2-1.63B2-1.19C2-1.62D2。

方差分析結果見表4。

表4 紅棗多糖提取率響應面試驗回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiment regression model for jujube polysaccharide extraction rate

根據表4可知 B、D、A2、B2、C2、D2、AC 對紅棗多糖提取率影響極顯著（P＜0.01）；A、AD對紅棗多糖提取率影響顯著（P＜0.05）；C、AB、BC、BD、CD 對紅棗多糖提取率影響不顯著（P＞0.05）。根據F值可知，紅棗多糖提取率的影響因素從大到小依次：含水量＞超聲時間＞超聲溫度＞料液比。由模型P值＜0.000 1，極顯著；失擬項P值為0.126 9，不顯著；R2以及RAdj2分別為0.960 4和0.920 8，可知該模型擬合度較好。由此可知，該模型可以較真實的反應紅棗中多糖提取率的提取情況。

2.3.3 交互作用分析

各因素交互作用影響結果見圖6。

圖6 各因素交互作用對紅棗多糖提取率的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on extraction rate of jujube polysaccharide

通過等高線圖和3D圖可以直觀發現各因素交互作用對紅棗多糖提取率的影響。由圖6中的等高線可知，超聲溫度與料液比和含水量之間所呈現的形狀為橢圓形，且等高線較密集；且相對應的3D圖坡度陡峭，表明超聲溫度與料液比和含水量之間的交互作用對紅棗中的多糖提取率影響較大，與方差分析表中的結論相符合。

2.3.4 最優工藝條件確定及驗證試驗

通過響應面軟件分析得出，紅棗多糖最優的提取條件為超聲溫度39.21℃，超聲時間31.00 min，料液比1∶9.82（g/mL），含水量 21.84%，在此條件下，預測的紅棗多糖提取率為8.23%。考慮實際情況，調整提取工藝為超聲溫度 40 ℃，超聲時間 30 min，料液比 1∶10（g/mL），含水量為20%，在此條件下進行3次驗證試驗，得出紅棗多糖提取率為（8.33±0.26）%，與模型中預期的結果差異不顯著，表明該優化結果可靠，可以用于提取紅棗多糖的工藝。

3 結論

在快速發展的食品工業中，傳統溶劑提取紅棗多糖已不能滿足市場需要。由于超聲輔助低共熔溶劑提取多糖具有耗時短、提取簡單、提取率高的優點，本試驗采用超聲輔助低共熔溶劑提取紅棗多糖，以多糖提取率為評價指標，確定了以氯化膽堿與尿素摩爾比1∶2為低共熔溶劑體系的優化工藝，通過響應面法確定了最優提取工藝為超聲溫度40℃，超聲時間30 min，料液比1∶10（g/mL），含水量20%；在此優化工藝條件下，多糖提取率高達8.33%。該工藝為日后食品工業中紅棗多糖的提取奠定了理論基礎。