基于液相色譜的菊苣及其相關產品中6種功能成分的分析方法

李晶，錢曉國，許洪高，陳小強，魯緋*

（1.北京市營養源研究所有限公司，北京 100069；2.北京市系統營養工程技術研究中心，北京 100069；3.河北省菊苣膳食纖維技術創新中心，河北 承德 130826）

菊苣（Cichorium intybus L.）是一種多年生菊科菊苣屬草本植物[1]，在世界各地均有栽培[2]，在我國主要分布于新疆、遼寧、山西、黑龍江、北京和江西等地[3]。菊苣是一種藥食兩用植物，1977年被納入我國國家藥典，具有清熱解毒、利尿消腫和健胃等功效。菊苣的葉子和根可作開胃菜、制作瀉藥和利尿茶，而菊苣根提取物菊粉作為一種膳食纖維在食品生產中的應用也越來越廣泛[4-7]。

近年來，人們對菊苣植物化學成分越來越感興趣。研究證明菊苣中除了具有豐富的營養成分[8]，如碳水化合物、脂肪、蛋白質、氨基酸、維生素E、β-胡蘿卜素、玉米黃質和礦物質等，還含有多種具有潛在生物活性的功能成分，如倍半萜內酯、咖啡酸衍生物、香豆素類、黃酮類、生物堿和類固醇等[2，9-11]。這些生物活性物質顯示出廣泛的生物學和藥理特性，如抗高尿酸血癥、抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤、抗氧化和抗增殖、保肝護肝、抗菌等作用[1-2，8，10-16]。此外，菊苣中的一些化合物，如多酚[11-12]、菊粉[4-7]和倍半萜內酯[15]等被認為是食品功能的潛在載體，它們的含量是菊苣及其相關產品品質的一個重要指標。因此，菊苣中功能成分的準確定量，對菊苣及其相關衍生產品（包括食品和保健品）的品質評價和質量控制具有十分重要的意義。

菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素、秦皮乙素、山萵苣素和山萵苣苦素是菊苣中6種重要的生物活性化合物，它們的分子結構如圖1所示。

圖1 6種功能成分的分子結構圖Fig.1 Molecular structure diagrams of the six functional components

咖啡酸衍生物菊苣酸和綠原酸屬于多酚類化合物，分子中含有多個羥基和羧基。目前，綠原酸和菊苣酸等多酚類化合物的定量分析方法有高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）紫外可見（ultra violet-visible，UV-Vis）或二極管陣列（Diode array detector，DAD）檢測法[11，17-20]、液相色譜串聯質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[11，21]和毛細管電泳法（capillary electrophoresis）DAD 檢測[22]等。秦皮甲素和秦皮乙素是簡單香豆素類化合物[23]，它們是只在苯環一側有取代，且7位羥基未與6位或8位取代基形成呋喃環或吡喃環的香豆素類，其主要分析方法為液相色譜紫外可見或二極管陣列檢測法[24-26]。山萵苣素和山萵苣苦素是菊苣中的主要倍半萜內酯類化學成分，倍半萜內酯是菊苣屬植物呈苦味和具有抗瘧、保肝、鎮痛等生物活性的主要原因[15]。由于山萵苣素和山萵苣苦素具有較強烈的苦味，它們在菊苣和相關衍生產品中的存在應有效地控制，以使產品品質呈現最佳狀態[27]。山萵苣素和山萵苣苦素的定量分析方法主要有HPLC[25-28]和HPLC-MS/MS法[29]。然而，目前還未見同時測定上述6種功能成分含量的分析方法的相關報道。

本研究建立了同時測定菊苣及其相關產品中菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素、秦皮乙素、山萵苣素和山萵苣苦素6種功能成分含量的HPLC和超高效液相色譜法（ultra high-performance liquid chromatography，UPLC）分析方法。兩種分析方法準確性好，靈敏度高，可作為監控菊苣藥材、提取物及其他相關衍生產品中6種功能成分含量的技術手段，有助于質量控制和評價菊苣及其相關產品的應用開發。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊苣根、菊苣蓉（菊苣加工副產物）：豐寧平安高科實業有限公司。

山萵苣素（純度≥95%）、山萵苣苦素（純度≥95%）、菊苣酸（純度≥98%）、綠原酸（純度≥98%）、秦皮甲素（純度≥98%）、秦皮乙素（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜級）：Fisher Chemical公司；磷酸（分析純）：北京化工廠。本試驗所用水為超純水。

1.2 儀器與設備

Thermo Scientific Vanquish系列UHPLC液相色譜儀（含VH-P10高壓二元體系泵、VH-A10自動進樣器、LC-VQ柱溫箱、HL型二極管陣列檢測器和Chromeleon 7.2 SR4色譜數據系統）：美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司；KQ5200DE型數控超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；HITACHI CF16RX高速冷凍離心機：日本日立工機（Hitachi Koki）有限公司；RE-2000A旋轉蒸發儀：鄭州科泰實驗設備有限公司；FiveEasy Plus FE28 pH計：瑞士梅特勒-托利多（Mettler Toledo）集團；MX-F渦旋混合器：北京聯合科儀科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將菊苣根和菊苣蓉烘干，粉碎均勻后過80目篩。準確稱取（1.000 0±0.000 1）g樣品于50 mL離心管中，加入70%的甲醇水溶液20 mL，混勻后在35℃～40℃水浴中超聲提取30 min（輸入總功率為700 W，超聲頻率為 40 kHz），在 80 000 r/min離心 15 min，將上清液轉移至100 mL雞心瓶中；殘渣中再加入70%的甲醇水溶液20 mL，按照上述條件再重復超聲提取、離心，合并上清液于100 mL雞心瓶，在45℃旋蒸至近干，用70%的甲醇水溶液溶解后轉移至10 mL容量瓶并定容至刻度，混勻后經0.22 μm微孔濾膜過濾，待用。

1.3.2 標準溶液的配制

精密稱取山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素標準品各（10.00±0.01mg）于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻后作為儲備液，于-20℃避光保存，測定前進行系列標準溶液的稀釋。

1.3.3 色譜條件

1.3.3.1 HPLC條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；柱溫：30℃；山萵苣素和山萵苣苦素檢測波長為258 nm，菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素檢測波長為330 nm；流動相A為0.1%H3PO4水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序為：0～5 min，5.0%～15.0%B；5 min～15min，15.0%～25.0%B；15 min～25 min，25.0%～50.0%B；28 min～30 min，80%B；30 min～33min，80.0%～5.0%B；33 min～40 min，5.0%B。流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。根據保留時間（配合紫外光譜）定性目標化合物，使用外標法根據峰面積定量。

1.3.3.2 UPLC條件

色譜柱：Thermo Scientific Accucore Vanquish C18+（2.1mm×100 mm，1.5μm）；柱溫：30℃；檢測波長和流動相同1.3.3.1；梯度洗脫程序：0～8min，5.0%～7.0%B，8min～9 min，7.0%～32.0%B，9 min～11 min，32.0%B，11.5 min，5%B，11.5 min～15.0 min，5.0%B；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL。根據保留時間（配合化合物紫外光譜）定性化合物，使用外標法根據峰面積定量。

1.3.4 標準曲線的繪制

移取一定量的標準儲備溶液，用甲醇稀釋配制為質 量 濃 度 為 0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL 和 100.00 μg/mL 的系列標準溶液。按照1.3.3的色譜條件進行色譜分析，分別以山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素的質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）作圖，進行線性回歸分析。相關系數R2>0.999時進行樣品定量分析。

1.3.5 加標樣品回收率的測定

準確稱取1 g菊苣蓉樣品6份，分別加入200 μg的山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素，按照1.3.1的方法進行樣品的預處理，再按照1.3.3的色譜條件進行測定，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

根據山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素的最大吸收波長選擇檢測波長。6種功能成分的紫外可見光譜見圖2。

圖2 紫外可見光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectrum

由圖2可知，在紫外可見光譜區，山萵苣素在195.27 nm和258.57 nm有兩個最大吸收峰，山萵苣苦素在193.56 nm和258.41 nm有兩個最大吸收峰，菊苣酸在219.00、245.88 nm和332.22 nm有3個最大吸收峰，綠原酸在218.29、241.57 nm和327.57 nm有3個最大吸收峰，秦皮甲素在202.38、223.28 nm和335.72 nm有3個最大吸收峰，秦皮乙素在203.85、227.07 nm和346.55 nm有3個最大吸收峰。由于在紫外光譜區的分子吸收干擾多，因此通常選定接近可見光譜區長波方向的最大吸收波長為檢測波長。在258 nm波長下，山萵苣素和山萵苣苦素有最大吸收峰，兩種成分得到了較好的分離，確定258 nm為山萵苣素和山萵苣苦素的檢測波長。在330 nm波長下，菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素都接近最大吸收峰，6種成分的分離效果好，因此確定330 nm為菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素的檢測波長。

2.2 流動相的選擇

考察了不同流動相和流動相配比對山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素色譜行為的影響，也對在HPLC法中使用的色譜柱[Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 色譜柱和Thermo Scientific Hypersil GOLD C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]和在UPLC法中使用的色譜柱[Thermo Scientific Accucore Vanquish C18+（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）色譜柱和Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱]進行了選擇。采用不同的梯度洗脫方式進行色譜分析，比較了甲醇和水流動相、乙腈和水流動相、甲醇和乙酸水流動相、乙腈和乙酸水流動相、甲醇和磷酸水溶液流動相以及乙腈和磷酸水溶液流動相對實際樣品的分離效果，結果見圖3。

圖3 不同流動相條件試驗色譜圖Fig.3 Chromatogram with different mobile phase conditions

如圖3A～3D所示，流動相中有機相為乙腈時，色譜峰峰形更好，響應值更高，在相同的洗脫梯度條件下色譜峰出峰時間也更快，并且采用酸性流動相時的分離效果更佳。圖3E～3G是乙腈和不同濃度（0.05%、0.1%、0.3%）磷酸水溶液作為流動相時的色譜圖。顯然，當流動相中磷酸的濃度由0.05%增加至0.1%時，色譜峰峰形更好，而流動相中磷酸的濃度為0.1%和0.3%時，色譜分離度和峰形無明顯差別。磷酸水溶液濃度越高，pH值越低。通常，C18色譜柱適用的酸度范圍是pH值為2～8，而Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱的適用酸度范圍為pH值1～8，更適合酸性流動相。因此，確定以0.1%的磷酸水溶液和乙腈作為流動相，通過優化兩相配比，采用梯度洗脫方式對6種功能成分進行分離。6種功能成分在Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）分析柱上的出峰順序為秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、山萵苣素、菊苣酸和山萵苣苦素，色譜分離度和峰形良好，選擇Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為 HPLC 法測定6種功能成分的分離柱。考察了流速在0.8 mL/min～1.2 mL/min范圍內對分離效果的影響，在合理時間內，1.0 mL/min的流速是分離效果最佳的流速。

流動相為0.1%磷酸和乙腈時的UPLC色譜圖見圖4。

圖4 流動相為0.1%磷酸和乙腈時的UPLC色譜圖Fig.4 UPLC chromatogram with mobile phase of 0.1%phosphoric acid and acetonitrile

如圖4所示，UPLC法中6種功能成分在Accucore Vanquish C18+分析柱上的出峰順序為秦皮甲素、秦皮乙素、綠原酸、山萵苣素、菊苣酸和山萵苣苦素，色譜分離度和峰形良好。在Accucore Vanquish C18+色譜柱上，秦皮乙素比綠原酸先洗脫出來，山萵苣素和菊苣酸的色譜行為更相似，保留時間更接近，選擇Accucore Vanquish C18+（2.1 mm×100 mm，1.5 μm）作為 UPLC法測定山萵苣素、山萵苣苦素、菊苣酸、綠原酸、秦皮甲素和秦皮乙素的分離柱。選擇同一檢測波長進行檢測，即在258 nm對6種功能成分進行定量測定，秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素和菊苣酸的檢測靈敏度會低于檢測波長為330 nm的靈敏度。相比HPLC法，UPLC法在維持分離度的同時增加了通量，減少分析時間的同時提高了分離度，提高了色譜分離效率。

2.3 試樣提取方法的選擇

植物中功能成分的提取方法包括煎煮、浸漬、滲漉、回流和連續提取的傳統溶劑提取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、加速溶劑萃取法以及其它萃取法如分散液液微萃取法等。超聲波提取法具有設備和操作簡單、低溫提取、提取物活性高且提取率高的優點[30]。超聲波輔助提取法中，超聲波產生的強烈振動、高速和強烈的空化效應、攪拌作用，破壞了植物組織的細胞，細胞膜的破裂和細胞壁的機械破壞使得提取溶劑可迅速滲透到細胞質和細胞液中，加速植物化學成分的浸出，并且這種可以控制的溶劑滲透到植物組織基質中的過程能夠防止提取產物變性[31]，而原料粒徑的減小和溶劑用量的增加都有助于提高有效成分的提取產量[30-33]。Mazvimba 等[31]、Stuart等[32]和Saleh等[33]的研究指出，采用甲醇（或乙醇）和水的混合提取溶劑而不是100%的甲醇（乙醇）或100%的水有助于提高超聲萃取中功能成分的有效提取產量，并相應地降低蛋白質和多糖等雜質的溶出或提取物摻假。試驗中比較了不同提取溶劑、超聲提取溫度和時間對6種功能成分超聲波萃取的提取效果，結果見表1。

表1 不同提取條件對提取效果的影響Table 1 Influence of different extraction conditions on the extraction effect

如表1所示，確定以70%甲醇水溶液作為提取溶劑。超聲提取溫度為28、30、35、40℃時，對6種功能成分的提取效率影響很小，超聲提取溫度為40℃時綠原酸的提取效率略有降低，因此，確定超聲提取溫度為35℃～40℃。提取時間為30 min時，提取效果最好。

確定提取方法：超聲提取時間為30 min，離心后收集上清液于雞心瓶中，殘渣中再加入20 mL提取溶劑后重復處理1次，合并兩次的上清液，在45℃旋蒸至近干，用70%甲醇水溶液復溶后，轉移至10 mL容量瓶并定容至刻度。

2.4 標準曲線的線性范圍和精密度

分別將不同濃度的6種功能成分混合標準溶液按HPLC和UPLC色譜條件進行測定，得到標準溶液色譜圖，見圖5。

圖5 HPLC標準溶液色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of standard solution

HPLC法分離秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、山萵苣素、菊苣酸和山萵苣苦素的保留時間分別為8.050、8.986、10.935、17.914、11.811 min 和 23.747 min，UPLC法分離秦皮甲素、秦皮乙素、綠原酸、山萵苣素、菊苣酸和山萵苣苦素的保留時間分別為3.836、5.736、6.186、9.576、9.966 min和 11.292 min，綠原酸在 Vanquish C18+色譜柱上的保留時間比秦皮乙素更長。

以6種功能成分的質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標作圖，得到線性回歸方程見表2。

表2 6種功能成分的標準曲線回歸方程、線性范圍Table 2 Regression equation and linear range of standard curves for the six components

由表2可知，6種功能成分的濃度與峰面積具有良好的相關性。以10 μg/mL的混合標準溶液連續重復進樣8次進行精密度試驗，6種功能成分測定結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）的最大值分別是0.058%（HPLC法）和0.079%（UPLC法），表明精密度滿足方法學定量的要求。

2.5 方法的檢出限和定量限

根據國家標準GB/T 27417—2017《合格評定化學分析方法確認和驗證指南》對檢出限和定量限的規定，以3∶1的信噪比確定方法的檢出限，以10倍的信噪比確定方法的定量限。HPLC法和UPLC法測定6種化合物的檢出限和定量限列于表3。

表3 HPLC法和UPLC法測定6種功能成分的檢出限和定量限Table 3 Limit of detection and limit of quantitation of the six functional components determined by HPLC and UPLC mg/kg

由表3可知，相比HPLC法，UPLC法具有更高的檢測靈敏度。這一結果可能由于UPLC法所使用的Accucore Vanquish C18+色譜柱性能和柱效影響了秦皮甲素、綠原酸、秦皮乙素、山萵苣素、菊苣酸和山萵苣苦素的分析效果，響應值偏低導致檢出限和定量限均高于HPLC法。

2.6 方法的準確度和重復性試驗

對方法的準確性進行考察，選擇菊苣蓉樣品進行加標回收試驗。在1.3優化后的試驗條件下，分別對200 μg/g添加水平的6個平行樣品進行測定，回收率結果和重復性試驗的RSD見表4。

表4 回收率試驗結果Table 4 Recovery test result

HPLC法6種功能成分的平均回收率為97.0%～103.6%，RSD值均小于等于3.98%，UPLC法6種功能成分的平均回收率為97.3%～102.4%，RSD值均小于2.96%，符合國家標準GB/T 27417—2017對方法回收率和正確性的規定，表明方法是可靠和準確的。

菊苣蓉樣品本底和加標樣品的色譜圖見圖6。

圖6 菊苣蓉樣品和加標樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of chicory processed product sample and spiked sample

2.7 樣品中6種功能成分的含量

菊苣根和菊苣蓉樣品中的6種功能成分的含量見表5。

表5 樣品中6種功能成分的含量Table 5 Content of the six functional components in the sample mg/kg

由表5可知，菊苣根中6種功能成分的含量大小為綠原酸＞菊苣酸＞山萵苣苦素＞山萵苣素＞秦皮乙素＞秦皮甲素。由菊苣根提取的菊苣蓉中不含秦皮甲素和秦皮乙素，其它4種化合物的含量大小依次為山萵苣苦素＞山萵苣素＞菊苣酸＞綠原酸，且大大低于它們在菊苣根中的含量，綠原酸的含量為最低。

菊苣根樣品的HPLC法和UPLC法色譜圖見圖7。

圖7 菊苣根樣品的色譜圖Fig.7 Chromatogram of chicory root residue sample

由圖7可知，兩種分析方法均適用于菊苣樣品中6種功能成分的含量測定。

3 結論

菊苣中富含多種生物活性物質，它們的含量是菊苣及其衍生產品品質的一個重要指標。本研究建立了測定菊苣及其相關產品中秦皮甲素、秦皮乙素、綠原酸、菊苣酸、山萵苣素和山萵苣苦素含量的HPLC和UPLC分析方法。采用HPLC法在25 min內6種功能成分分離度良好，應用UPLC法12 min內6種功能成分完全分離。優化了樣品制備方法和色譜分離條件。采用70%甲醇水溶液超聲提取功能成分，C18色譜柱分離，柱溫30℃，以0.1%磷酸水溶液和乙腈作為流動相，HPLC法中流動相流速為1.0 mL/min，UPLC法中流動相流速為0.4 mL/min，紫外檢測器258 nm對山萵苣素和山萵苣苦素進行檢測，在波長330 nm對秦皮甲素、秦皮乙素、綠原酸和菊苣酸進行檢測，兩種方法重復性測定結果的相對標準偏差均小于4%，回收率在97.0%～103.6%范圍內。HPLC法6種功能成分的檢出限最低為0.49 mg/kg，最高為2.14 mg/kg，定量限最低為1.65 mg/kg，最高為7.14 mg/kg；UPLC法6種功能成分的檢出限最低為1.11 mg/kg，最高為5.24 mg/kg，定量限最低為3.72 mg/kg，最高為17.50 mg/kg。方法學驗證結果表明，兩種分析方法準確性好，具有較好的精密度、重復性、穩定性和較大的線性范圍，均適用于菊苣及其相關衍生產品中6種功能成分的含量測定。UPLC法的分析速度快，HPLC法適用范圍更廣泛，可以作為菊苣合理利用以及相關產品質量評價的科學依據，具有一定的理論意義和應用價值。