高通量測序揭示高、低溫季節下長牡蠣菌群變化

徐皓月，張翔，谷莉，白昌明，辛魯生，王文彬，王崇明*

（1.江蘇海洋大學食品科學與工程學院，江蘇 連云港 222000；2.中國水產科學研究院黃海水產研究所青島海洋科學與技術國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室農業部海水養殖病害防治重點實驗室青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室，山東 青島 266071）

牡蠣又稱為生蠔，根據《2020中國漁業統計年鑒》[1]，2019年貝類總產量占全國海水養殖產量的69.67%，其中牡蠣產量占比為36.31%。牡蠣肉鮮美多汁，富含多種人體日常所需要的營養成分，營養價值較高，一直以來被稱作“海洋牛奶”[2]。我國養殖牡蠣種類較多，而市場中常見的食用牡蠣品種是長牡蠣。長牡蠣又稱太平洋牡蠣，原產于亞洲東部，具有抗逆性強、生長快等優點[3]，被廣泛引進到全球多個國家和地區養殖，也是我國經濟海產品中產量最大的貝類[1-4]。近幾年，未經烹飪的鮮牡蠣受到部分消費者的喜愛，尤其是冬季牡蠣集中上市季節（11月到次年3月）。而貝類濾食這一特性使得牡蠣易于富集海洋環境中的致病菌，從而成為人類致病菌的攜帶者。江河及海洋環境中普遍存在著大量的弧菌，是牡蠣中最常見的食源性致病菌，這些細菌往往會通過未被充分加熱的海產品或交叉污染的食物進入人體，導致腹瀉、嘔吐等急性腸胃炎癥狀[5-7]。長牡蠣所攜帶的微生物造成了長牡蠣食用過程中的安全隱患，而其體內的微生物群落組成與長牡蠣生長或繁殖的環境有著巨大關系。在水體環境和生物餌料的影響下，長牡蠣體內微生物種類、數量組成在時間和空間維度上存在差異[8]，給生食長牡蠣引發食源性疾病的風險評估造成困難。傳統微生物群落分析多依賴于培養微生物與其他方法相結合，但這種研究方法的局限性很大。而近幾年來，快速發展的高通量測序技術可以同時對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，具有高準確性、高通量、高靈敏度和低運行成本等優勢，不僅突破了傳統微生物學限制，而且可以在同一時間檢測樣品中的高豐度菌群和低豐度菌群，并將這些菌群的豐富度用數字的方式直觀地呈現出來[9]。

有學者采用Illumina HiSeq高通量測序技術對牡蠣的微生物群落結構及其在冷藏過程中的變化進行了分析[10-11]，在初始階段，牡蠣體的細菌群落在屬水平上豐度最高的菌屬為弧菌屬（Vibrio）、希瓦氏菌屬（Shewanella）和交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas）。長牡蠣在不同季節下的品質有較大差異，食用安全風險也有可能不同，其微生物群落的季節變化目前尚未有研究報道。本文通過高通量測序技術分析高溫季節和低溫季節的長牡蠣微生物群落結構及其變化，旨在提供基礎信息以便可以更加深入地研究長牡蠣的菌群組成、風險評估及相關調控技術。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

長牡蠣：青島市即墨區鰲山灣牡蠣養殖場。高溫季節采樣日期為2019年08月01日，當日海水溫度25.2℃；低溫季節采樣日期為2019年11月12日，當日海水溫度15.3℃。樣本采集后放置于便攜式冰箱中保存，并立即返回實驗室，從采集的樣本中選取5只完整個體作為5份平行樣本，使用無菌海水沖洗后，使用已滅菌的刀具小心割斷其閉殼肌，使得外殼能夠完整去除，從而保留樣本軟體組織的完整性，在潔凈工作臺中切割挑取長牡蠣的閉殼肌、鰓、外套膜和肝胰腺4個組織，置于無菌離心管中。將最后提取出來的20個樣本簡單處理后，進行高通量測序。

磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）：北京索萊寶科技有限公司；taq mix酶：寶日醫生物技術（北京）有限公司；引物515F、806R：上海生工生物工程股份有限公司；GeneJET膠回收試劑盒：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒：Illumina公司；硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS）瓊脂培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

1.1.2 儀器與設備

Veriti 96孔梯度型PCR擴增儀、S-2000凝膠成像儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DYY-6C電泳儀、WD-2105A微型離心機：北京六一生物科技有限公司；LRH-250F生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；OSE-Y30電動研磨器：天根生化科技（北京）有限公司；MK2000-2干式恒溫器：杭州奧盛儀器有限公司；CX30 DC速凍車載冰箱：佛山市艾凱電器有限公司；NovaSeq6000基因測序儀：Illumina公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 傳統培養條件下高、低溫季節長牡蠣弧菌變化

高溫、低溫季節同批樣本各選取20個長牡蠣分別采用TCBS瓊脂培養基（用于篩選弧菌）進行傳統純培養分析，分離株通過16S rDNA測序鑒定。

1.2.2 DNA提取和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增

樣本基因組DNA采用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）[12]法提取，通過濃度為1%的瓊脂糖凝膠在100 V電壓下電泳40 min檢測DNA的純度，采用微量紫外法進行定量。根據鑒定細菌多樣性的試驗目的，選擇V4區進行測序，PCR擴增使用的引物分別為515F和806R[12]，樣本DNA采用無菌水稀釋至1 ng/μL作為擴增模板。引物序列為 515F:5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′；806R:5′-GCCAATGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。擴增程序：98 ℃，1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30 個循環；72 ℃ 延伸 5 min。

1.2.3 PCR產物的混合與純化

根據PCR產物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后進行PCR產物的純化，使用濃度為2%的瓊脂糖膠在80 V電壓下電泳40 min，隨后選擇長度為400 bp～450 bp的序列進行切膠回收。

1.2.4 文庫構建與測序

構建文庫使用TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒[13]，文庫構建好后經過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用NovaSeq6000進行上機測序。

1.2.5 測序數據處理

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣本數據，去除引物序列后使用Flash軟件[14]進行拼接，得到Tags數據；進一步過濾處理[15]得到Clean Tags。根據擴增子分析工具Qiime軟件[16]的Tags控制方法，進一步過濾Tags之后，Tags序列通過與物種注釋數據庫進行比對檢測嵌合體序列并去除[17]，得到有效數據。

1.2.6 分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種注釋

對1.2.5節得到全部有效數據通過Uparse軟件[18]進行聚類，將Identity≥97%Tags數據聚類成OTUs。

對OTUs序列使用Mothur方法與SILVA132[19]的SSUrRNA數據庫[20]進行物種注釋（定閾值為0.8～1.0），獲得分類學信息并分別從界至種各個分類水平統計各樣本的群落組成。使用MUSCLE[21]軟件進行多重序列比對，得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。

根據所有樣本在綱水平的物種注釋及豐度信息，選取豐度比為前20的屬根據豐度信息進行聚類，以便于樣本中顯著差異物種水平聚集。

1.3 數據處理

為了對高、低溫季節長牡蠣體內微生物群落變化情況進行分析，將高溫和低溫季節各5份長牡蠣、共20個組織樣本的測序數據通過NovoMagic云平臺合并成高溫季節組和低溫季節組，并利用平臺處理數據和繪制相關的數據圖進行比較分析。同時，將高溫季節5份長牡蠣的鰓、閉殼肌、外套膜、肝胰腺組織的測序數據合并，低溫季節5份長牡蠣的鰓、閉殼肌、外套膜、肝胰腺組織測序數據也按照組織類型合并，采用平臺處理數據和繪制相關的數據圖進行比較分析。根據物種注釋結果，選取高、低溫季節或不同組織在不同分類水平上豐度值排名前十的物種生成相對豐度柱形圖，對長牡蠣菌群物種組成情況進行展示。使用Qiime 軟件計算 Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goodscoverage指數，使用R軟件繪制稀釋曲線、等級聚類曲線。采用統計學分析指數評估樣本中微生物群落的物種豐富度（ACE指數和Chao1指數）和多樣性（Shannon指數和Simpson指數）。

2 結果與討論

2.1 測序數據統計

稀釋曲線（rarefaction curve，RC）和等級聚類曲線（rank abundance curve，RAC）常用于描述組內樣本多樣性。圖1展示了樣本的稀釋曲線和等級聚類曲線圖。

圖1 稀釋曲線和等級聚類曲線Fig.1 Rarefaction curve and rank abundance

由圖1可知，隨著測序數量的增加，稀釋曲線趨向平緩，能夠看出測序數據量逐漸合理，即使有更多的數據量對與發現新的OTUs邊際貢獻也很小，而從等級聚類曲線的寬度和平滑程度能夠看出兩組樣本中物種分布比較均勻，夏季長牡蠣樣本中的物種豐富度要高于低溫季節長牡蠣樣本。

微生物群落的豐度和多樣性可通過Alpha多樣性來反映[22]。ACE指數和Chao1指數揭示樣本中細菌群落的豐富程度，Shannon指數和Simpson指數揭示樣本中細菌群落的多樣性。ACE指數與群落中物種數量呈正相關。Chao1指數與細菌群落的物種豐富度呈正相關。此外，Coverage代表各樣本的文庫覆蓋率，可以直接反映測序結果是否具有代表性。表1數據展示了樣本內的Alpha多樣性指數。

表1 Alpha指數統計表Table 1 Statistic graph of alpha indices

由表1可知，相比于高溫季節，低溫季節的長牡蠣樣本中，ACE指數、Chao1指數呈上升趨勢，而Shannon指數、Simpson指數呈下降趨勢，可以看出隨著季節溫度的降低，長牡蠣中微生物物種數量有所增加，但細菌群落的多樣性有所減少。且Coverage指數均在0.980以上，說明測序對樣本中細菌的覆蓋率高，并且測序深度符合分析長牡蠣樣品中細菌多樣性的要求[23]。

2.2 長牡蠣測序結果OTU聚類及物種注釋

2.2.1 OTUs聚類

利用高通量測序技術得到高溫和低溫季節長牡蠣樣本下機原始數據后，通過相關處理后，得到高溫季節樣本的有效序列范圍為39 767條～69 778條，平均長度范圍為408 bp～429 bp；低溫季節樣本的有效序列范圍為44 105條～69 381條，平均長度范圍為397 bp～416 bp。對高溫季節和低溫季節這兩個季節樣本的Effective Tags進行聚類后分別得到9625、9253個OTUs，其中高溫季節和低溫季節樣本共有OTUs 4 809個。

2.2.2 門、綱、目、科水平上高溫、低溫季節及不同組織間的長牡蠣物種注釋

高溫和低溫季節長牡蠣樣本整體的微生物物種注釋結果如圖2所示。

圖2 不同季節下在門、綱、目和科水平上長牡蠣中細菌群落的物種注釋結果Fig.2 Species annotation results of bacterial communities in Crassostrea gigas at phylum,class,order and family levels in different seasons

在門的水平上，高溫季節長牡蠣樣品中附著的主導細菌為變形菌門（Proteobacteria，40.35%）、厚壁菌門（Firmicutes，19.87%）、放線菌門（Actinobacteria，12.23%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，10.39%）；而低溫季節長牡蠣樣品中放線菌門占比從12.23%下降為4.14%，不再是優勢菌群；藍細菌門（Cyanobacteria）占比由2.61%上升為9.05%，其它變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門仍然是主導菌群。在綱、目、科水平上，高溫季節的長牡蠣樣品以γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，23.52%）、梭菌目（Clostridiales，14.45%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae，5.47%）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae，5.34%）和雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae，5.17%）為主；低溫季節的長牡蠣樣品以α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，33.00%）、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales，22.87%）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae，22.87%）為主，放線菌和藍細菌未得到更為詳細的物種分類，變化趨勢同門水平一致。部分細菌組成的季節差異變化可能與細菌特性有關，根據相關資料[24-25]，藍細菌在干燥、低溫和長期黑暗等條件下，可形成休眠狀態的靜息孢子，比放線菌更加耐寒抗凍。其他細菌種類如梭桿菌門（Fusobacteria）等在高溫和低溫季節群落中占比相差不大。

長牡蠣不同組織的菌群結構季節差異如圖3所示。

圖3 不同季節下長牡蠣4個組織中細菌群落在門、綱、目和科水平上的物種注釋結果Fig.3 Species annotation results of bacterial communities in 4 tissues of Crassostrea gigas at phylum，class，order and family levels in different seasons

高溫季節下鰓、閉殼肌和外套膜3種組織的菌群結構較為相似，優勢菌群為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門。肝胰腺組織的微生物群落組成與上述3種組織中的差異較大，其中厚壁菌門占比（27.90%）比上述3種組織（14.99%～19.74%）高；軟壁菌門占比17.74%，遠遠高于其它組織（＜1%）；而變形菌門占比為25.80%，遠低于在其它3個組織中的占比（42.75%～48.30%）。低溫季節下長牡蠣不同組織的微生物群落結構存在較大差異，變形菌門在閉殼肌中占比21.74%，遠小于在其它3種組織（46.92%～59.0%）；藍細菌門在肝胰腺中占比26.22%，而遠高于其它3種組織（1.24%～5.76%）；軟壁菌門在鰓中占比20.35%，遠高于其他3種組織（0.21%～0.76%）；擬桿菌門在閉殼肌中占比28.22%，遠高于其他3種組織（4.29%～6.95%）。

從高溫季節到低溫季節，隨著生長季節溫度的降低，長牡蠣鰓、肝胰腺、閉殼肌組織的菌群構成均發生了明顯變化。鰓組織中優勢菌群厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門占比減少；變形菌門占比略有增加，其中α-變形菌綱占比大幅增加，主要包括紅螺菌目、鞘脂單胞菌目，而γ-變形菌綱占比大幅減少；軟壁菌門（Tenericutes）從0.87%大幅增加至20.34%，主要包括軟壁菌綱、支原體目、支原體科微生物；在肝胰腺組織中，優勢菌群中厚壁菌門、軟壁菌門（支原體科）和放線菌門的占比大幅降低，藍細菌門的占比從6.31%大幅上升至26.30%。閉殼肌組織中，厚壁菌門、擬桿菌門占比上升明顯，而變形桿菌門占比大幅降低，其中莫拉氏菌科由19.06%降至0.16%。外套膜組織高低溫季節的菌群組成在門水平差異較小。從高溫季節到低溫季節，所有組織中變形菌門中的鞘脂單胞菌科細菌占比均大幅上升。

2.2.3 屬水平上高溫、低溫季節及不同組織間的長牡蠣微生物物種注釋

屬水平上高、低溫季節長牡蠣細菌群落組成情況如表2所示。

表2 高、低溫季節長牡蠣附著細菌群落在屬水平的分布情況Table 2 Distribution of bacterial communities attached to Crassostrea gigas at genus level in different seasons

高溫季節長牡蠣樣品中雙歧桿菌屬（5.11%）、棲水菌屬（5.03%）、內源性單胞菌屬（4.81%）和甲基桿菌屬（3.04%）占比相對較高，乳桿菌屬（1.98%）等其它細菌的占比較低。低溫季節的長牡蠣樣品中雙歧桿菌屬（0.58%）、棲水菌屬（0.05%）占比大幅降低，內源性單胞菌屬（3.50%）、甲基桿菌屬（1.79%）、乳桿菌屬（1.28%）占比有所降低，而鞘氨醇單胞菌屬（21.13%）、分類不明確的藍細菌（7.70%）、支原體屬（5.08%）的占比大幅增加。另外，高溫季節和低溫季節的長牡蠣樣本中存在大量占比＜0.1%的菌屬，分別達到63.42%和49.35%，表明長牡蠣組織的微生物種類組成整體較為復雜，且隨著季節溫度的降低組織的細菌群落結構略有簡化。

此外，食源性病原菌弧菌屬在青島鰲山灣養殖長牡蠣樣品中占比較小，并且從高溫季節到低溫季節存在較為明顯的降低趨勢，弧菌屬在高溫季節占比1.25%，在低溫季節僅占比0.10%。這一結果與傳統純培養的細菌16SrDNA鑒定結果一致，從20只高溫季節長牡蠣中分別分離到了46株弧菌，主要包括溶藻弧菌（11株）、克拉索氏弧菌（4株）、哈維氏弧菌（2株）和燦爛弧菌（2株）等，而從20只低溫季節長牡蠣中分離出17株弧菌，包括嗜環弧菌（5株）和燦爛弧菌（2株）等，高低溫季節均未分離到副溶血性弧菌。低溫季節生食長牡蠣的弧菌感染風險是否有所降低，有待進一步研究。

高通量測序可以詳細準確地反映長牡蠣不同組織、不同季節等附著的高豐度菌群和低豐度菌群。曹榮等[10-11]對牡蠣體中附著的細菌種類和牡蠣冷藏過程中的微生物群落變化進行了研究分析，研究發現新鮮牡蠣樣品中附著的細菌以變形菌門（77.50%）、γ-變形菌綱（72.30%）和弧菌目（Vibrionales，49.30%）為主[10]。牡蠣冷藏過程中隨時間推移，弧菌屬（28.30%～6.2%）占比迅速減少，希瓦氏菌屬（Shewanella，10.30%）占比先迅速下降至4.00%，后又增加至19.50%，而交替假單胞菌屬（Pseudoalteromons，7.20%～32.20%）占比增加[11]。本文所研究的長牡蠣菌群結構結果與上述報道在門和綱水平的優勢菌群是較為一致的，但在目水平存在一定差異，如弧菌屬在群落中占比較低，占比僅有1.25%和0.10%，這可能受多種因素的影響[11，26]，比如牡蠣的品種、生長水域、餌料、捕獲季節、捕獲手段等。

不同季節溫度下長牡蠣4個組織中微生物豐度聚類熱圖（屬水平）見圖4。

圖4 不同季節溫度下長牡蠣4個組織中微生物豐度聚類熱圖（屬水平）Fig.4 Heat map of microbial abundance in 4 issues of Crassostrea gigas at genus level in different seasons

物種豐度熱圖將不同豐度微生物反映在顏色梯度上，從而可以對比橫向的樣本信息和縱向的物種信息。由圖4可知，長牡蠣中細菌的組成隨季節溫度變化發生了顯著變化。從高溫季節到低溫季節，長牡蠣中雙歧桿菌屬、棲水菌屬和擬桿菌屬等菌類占比明顯下降，而鞘氨醇單胞菌屬、支原體屬（Mycoplasma）和分類不明確的藍細菌等菌類占比有明顯提升，這可能是因為這幾種菌類都能更好地適應低溫[24-25]，從而使得這幾種菌群在低溫季節中占比上升，成為長牡蠣中的高豐度菌群。由此可知，不同季節溫度下長牡蠣樣品的優勢細菌、種類及占比，均發生了改變。此外，可以清晰看出高溫季節的外套膜組織中弧菌屬占比（3.03%）明顯高于其他3個組織（0.48%～0.89%），且高溫季節4個組織中弧菌屬的占比均高于低溫季節4個組織（0.04%～0.16%）。之前的研究也表明副溶血性弧菌更容易定殖于外套膜中[27]，具體可能與夏季海洋環境中弧菌的豐度較高，長牡蠣濾食過程中外套膜與內臟等形成的外套腔直接與海水、排泄物等接觸有關。

2.2.4 菌群物種進化情況

通過多序列比對得到所有OTUs的系統進化關系，選取相對豐度前20的屬所對應的OTUs數據，并結合置信度信息構建系統發育樹，該菌屬所對應的門通過分支和扇形的顏色表示，不同樣本中該菌屬的豐度則由扇環外側的柱形圖來表示，結果見圖5。

圖5 OTUs的系統發育關系Fig.5 Phylogenetic relationship of OTUs

從圖5可以看出，鞘氨醇單胞菌屬、內源性單胞菌、支原體屬和分類不明確的藍細菌雖然在系統進化關系上相對較遠，但是相對豐度很高。

3 結論

為了掌握長牡蠣物種菌群組成情況，通過高通量測序法對高溫和低溫季節青島鰲山灣養殖長牡蠣軟組織中的微生物群落結構進行了測序。結果表明，高溫季節長牡蠣軟體組織群落以變形菌門、厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門為主，在屬水平上雙歧桿菌屬、棲水菌屬、內源性單胞菌屬和甲基桿菌屬的豐度較高。而低溫季節長牡蠣軟體組織中放線菌門占比大幅降低，藍細菌門占比有明顯上升，屬水平上鞘氨醇單胞菌屬、分類不明確的藍細菌和支原體屬的豐度較高。潛在食源性致病菌弧菌屬在高溫季節長牡蠣中占比（1.25%）高于低溫季節（0.10%），尤其是在高溫季節的外套膜組織（3.03%）占比較高。研究結果可為評估不同季節微生物群落組成對長牡蠣品質與安全的影響提供參考，長牡蠣群落的季節變化對長牡蠣品質、人體健康風險的影響應重點關注。