地衣芽孢桿菌分批補料發酵γ-聚谷氨酸

郭建敏，郭利飛，趙廷彬，李鎮江，江源剛，葉莉，唐曉芳，楊志剛，喬長晟*

（1.天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.天津市工業微生物重點實驗室，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；3.天津慧智百川生物技術有限公司，天津 300457；4.四川百川金開生物工程有限公司，四川 成都 610000；5.四川省食品發酵工業研究設計院有限公司，四川 成都 610000）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是由 D-谷氨酸和L-谷氨酸通過γ-羧基和α-氨基之間的酰胺鍵連接的陰離子均聚酰胺[1]，其分子量大小在104kDa～108kDa之間[2]。γ-PGA是一種水溶性的可食用高分子氨基酸聚合物，其不具備免疫原性，對人體無害，且生物可降解[3]。由于具有這些特性，它在食品、醫藥、化妝品、農業和廢水處理領域具有廣泛的應用[4-8]。自從Lvanovice在炭疽芽孢桿菌中第一次發現γ-PGA[9]，至今已經報道了多種產γ-PGA的芽孢桿菌，如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。產生 γ-PGA的菌株根據生物聚合物生產對L-谷氨酸的需求分為兩類：L-谷氨酸依賴性和非依賴性菌株。依賴于L-谷氨酸的菌株，在其培養基中添加前體物L-谷氨酸能夠高水平地生物合成γ-PGA[10]。由于非依賴性菌株發酵γ-PGA產量不高，當前市場上主要利用L-谷氨酸依賴性菌株進行γ-PGA生產[11]。

在獲得高產菌株的前提下，通過優化發酵培養基（如碳源、氮源、無機鹽等）、優化發酵條件（如溫度、pH值、溶氧等）、選擇合適的發酵方式（如分批發酵、連續發酵、分批補料發酵等）是提高γ-PGA產量的重要手段[12-13]。在分批發酵中，一次性投料過多容易造成發酵液環境突變，不利于菌種生長代謝和目標產物的積累[14]。分批補料發酵是在發酵過程中對營養物質濃度進行控制，給菌體提供適宜的生長環境，使菌體的生產狀態保持最大化，同時提高底物消耗利用率，實現目標產物提升的手段。王云龍等[15]通過分批補料蔗糖、蛋白胨、玉米漿，將L-天冬酰胺酶的酶活提高到了1 413.60 U/mL，較分批發酵提升了66.20%。Huang等[16]通過優化初始酵母膏、L-谷氨酸濃度以及分批流加葡萄糖的方法，將γ-PGA產量提高到了101.10 g/L。Kongklom等[17]通過在發酵過程中添加葡萄糖、檸檬酸和氯化銨的方法，將γ-PGA的產量提高到39.60 g/L。

本文利用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.3336生產γ-PGA，使用葡萄糖和硫酸銨作為碳源和氮源，前期研究葡萄糖的最適初始濃度為90 g/L，硫酸銨的最適初始濃度為7 g/L[18]。在γ-PGA生產過程中，存在葡萄糖和氨氮在發酵40 h左右就被消耗殆盡的情況，所以本研究采用分批補料發酵方式式，通過流加葡萄糖溶液和硫酸銨溶液，對發酵液中葡萄糖濃度和氨氮濃度進行控制，并確定出持續補料時間，從而提升菌體生產γ-PGA的能力，為工業上高效生產γ-PGA提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.3336：天津北洋百川生物技術有限公司；硫酸鎂、硫酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸銨、硫酸鉀、葡萄糖（均為分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；味精（工業級）：梅花生物科技集團股份有限公司；酵母膏（食品級）：安琪酵母股份有限；酵母浸粉、胰蛋白胨、蛋白胨（食品級）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

FE20 pH計：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；TGL-16G高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；752紫外分光光度計：天津市光學儀器廠；SBA-40E生物傳感儀：山東省科學院生物研究所；LC-20AT高效液相色譜分析儀：日本島津儀器有限公司；GRJB-5D 5 L發酵罐：鎮江格瑞生物工程有限公司；BIOTECH 30 L、200 L發酵罐：上海保興生物設備過程有限公司；NDJ-8S黏度計：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；YM滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養基的配制

固體培養基：NaCl10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，瓊脂2%。調節初始 pH7.2～7.3，121℃滅菌20 min。

種子培養基：葡萄糖30g/L（單獨滅菌），酵母膏7 g/L，胰蛋白胨6 g/L，蛋白胨4 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，調節初始 pH7.2～7.3，121℃滅菌 20 min。

發酵培養基：味精70g/L（單獨滅菌），葡萄糖90g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨5g/L，（NH4）2SO47g/L，K2SO415g/L，CaSO4·2H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.1 g/L，甘油 60 mL/L。調節初始 pH7.2～7.3，121℃滅菌20 min。

補料培養基：葡萄糖750 g/L（單獨滅菌），硫酸銨30 g/L（單獨滅菌）。

1.3.2 菌種培養方法

種子活化：在無菌操作臺用接種環從甘油管中蘸取2～3環菌液，劃線于固體培養基，放置在37℃恒溫培養箱中培養16 h。然后將培養皿中的菌種挑起，并均勻涂抹于斜面培養基上，37℃恒溫培養12 h。

種子培養：接種前將滅菌后的葡萄糖溶液轉入裝有種子培養基的三角瓶中，然后使用接種環將活化好的菌種斜面接種于裝有100 mL種子培養基的500 mL無擋板三角瓶中，置于轉速為220 r/min的37℃恒溫搖床中培養14 h～16 h。

5L發酵罐發酵培養：接種前投入單獨滅菌的味精600mL，調初始pH7.2～7.3，將300mL種子液轉入發酵罐中，總裝液量達到3 L。調節通風量為1.25 m3/（m3·min），攪拌轉速為400 r/min，溫度為37℃，罐壓為0.02 MPa，培養72 h。

30 L種子罐培養：在無菌操作室內將試管中的菌體斜面使用無菌水洗起，均勻涂抹于2個裝有固體培養基的茄子瓶中，放置于37℃恒溫培養箱中培養12 h。然后將茄子瓶中菌體用無菌水洗起，與單獨滅菌好的葡萄糖一起轉入裝有種子培養基的30 L種子罐中，總裝液量達到15 L，調節通風量為1.25 m3/（m3·min），攪拌轉速為300 r/min，溫度為37℃，罐壓為0.02 MPa，培養至 OD660達到 0.21～0.23。

200 L發酵罐培養：使用外置管路將30 L種子罐的15 L種子液導入裝有135 L發酵培養基的200 L發酵罐中，調節通風量為1.25 m3/（m3·min），攪拌轉速為300 r/min，溫度為37℃，罐壓為0.02 MPa，發酵72 h。

1.3.3 葡萄糖和硫酸銨流加方法

在發酵過程中，菌種在不同生長階段對營養物質消耗速率是不同的，所以采用變速流加方法，選取1.0、1.5、2.0 g/（L·h）為補料速率。在發酵過程中，當發酵液中葡萄糖質量濃度低于2、5、15、25 g/L時，開始流加濃度為750 g/L的葡萄糖溶液，使發酵液中的葡萄糖濃度維持在 2 g/L～5 g/L、5 g/L～15 g/L、15 g/L～25 g/L、25 g/L～35 g/L（葡萄糖濃度處于不同濃度范圍的臨界值時，作為小于當前濃度處理）；當發酵液中氨氮濃度低于0.1、0.5、1.0g/L時，流加濃度為75g/L的硫酸銨溶液，使發酵液中的氨氮濃度維持在 0.1 g/L～0.5 g/L、0.5 g/L～1.0 g/L、1.0 g/L～1.5 g/L（氨氮濃度處于不同濃度范圍的臨界值時，作為小于當前濃度處理）。

1.3.4 分析計算

1.3.4.1 菌體濃度測定

取1 mL發酵液至25 mL容量瓶，定容后以蒸餾水作為空白對照，采用分光光度計測定660 nm處的吸光度（OD660），稀釋倍數為固定數值25，用OD660表示菌體濃度。菌體濃度計算公式如下。

1.3.4.2 葡萄糖和谷氨酸濃度測定

取10 mL發酵液，在15 000 r/min條件下離心15 min，取1 mL上清液至100 mL容量瓶，定容后采用SBA-40生物傳感器測定葡萄糖濃度和谷氨酸濃度。

1.3.4.3 氨氮濃度檢測

氨氮濃度采用奈斯勒試劑，通過比色法測定[19]。

1.3.4.4 γ-PGA含量的測定

首先取1 mL上清液至50 mL容量瓶中，純凈水定容，然后使用0.22 μm微孔濾膜過濾，最后采用高效液相色譜分析儀檢測γ-PGA含量；色譜柱條件：Shodx SB-800HQ凝膠滲透色譜柱，0.05 mol/L無水硫酸鈉緩沖液洗脫，流速0.5 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進樣體積 20 μL。

1.3.4.5 生產強度的計算

生產強度計算公式如下。

式中：Y 為 γ-PGA 含量，g/L；t為發酵時間，d。

1.3.4.6 谷氨酸利用率的計算

谷氨酸利用率計算公式如下。

式中：M1為初始谷氨酸濃度，g/L；M2為發酵結束時谷氨酸濃度，g/L。

1.4 數據處理與分析

數據處理及作圖均使用Origin軟件完成。

2 結果與分析

2.1 維持不同葡萄糖濃度對發酵γ-PGA的影響

當葡萄糖濃度低于2、5、15、25 g/L時，采用分批補料發酵方式對發酵液的葡萄糖濃度進行控制。通過對發酵液的OD660、pH值、葡萄糖濃度、谷氨酸濃度、黏度、γ-PGA產量的測定，明確維持不同葡萄糖濃度對發酵γ-PGA的影響，結果見圖1。

圖1 維持不同葡萄糖濃度對發酵γ-PGA含量的影響Fig.1 Effects of different glucose concentrations on fermentation of γ-PGA

如圖1所示，不進行葡萄糖流加，菌體在48 h時進入穩定生長期，發酵結束時OD660達到0.44，谷氨酸濃度為31 g/L，γ-PGA 產量達到（34.01±0.53）g/L。當葡萄糖濃度維持在2 g/L～5 g/L、5 g/L～15 g/L，發酵72 h結束時，OD660皆達到了0.54；菌體進入穩定生長期的時間分別為51、54 h，指數生長期分別延長了3、6 h；發酵液中的谷氨酸濃度為28 g/L和25 g/L，谷氨酸利用率較不補料發酵提升了7.69%和15.38%；γ-PGA含量分別為（35.47±0.45）g/L 和（37.51±0.61）g/L，較不補料發酵提升了4.29%和10.29%。當葡萄糖濃度維持15 g/L～25 g/L、25 g/L～35 g/L，發酵 72 h結束時 OD660分別為0.44、0.40；菌體進入穩定生長期的時間分別為45、42 h，指數生長期分別縮短了3、6 h；發酵液中的谷氨酸濃度為33 g/L和39 g/L，谷氨酸利用率較不補料發酵降低了6.45%和25.80%；γ-PGA含量分別為（28.29±0.75）g/L和（27.51±0.73）g/L，較不補料發酵降低了16.81%和19.11%。

經過分析可知，γ-PGA伴隨著菌體的生長發育而積累，積累速率與生長狀態密切相關。在菌體處于指數生長期時，γ-PGA的積累速率最大，隨著菌種進入穩定生長期，γ-PGA的積累變緩。當菌體生長發育面臨營養物質缺乏時，谷氨酸鈉也可能被作為碳源和氮源所消耗利用[11]。維持葡萄糖濃度在2 g/L～5 g/L、5 g/L～15 g/L，有利于菌體的生長發育，使得菌體的指數生長期延長并保持一定的γ-PGA生產活性；進一步促進了底物谷氨酸的消耗利用，使得γ-PGA產量提高。維持葡萄糖濃度在 15 g/L～25 g/L、25 g/L～35 g/L 時，高濃度的碳源會對菌體的生長發育造成不同程度的抑制，使菌體提前進入穩定生長期，γ-PGA積累速率下降。在維持葡萄糖濃度為25 g/L～35 g/L時，出現了發酵液pH值明顯高于其他試驗組的情況，這可能是因為過高的碳源濃度造成菌體產生過量的副產物所引起的[20]，不利于γ-PGA的積累。綜上所述，選擇合適的補料時機并維持適宜的葡萄糖濃度，對菌體的生長發育和γ-PGA的積累具有一定的促進作用，所以選擇在發酵過程中葡萄糖濃度低于5 g/L時，通過流加葡萄糖溶液維持葡萄糖濃度在5 g/L～15 g/L。

2.2 維持不同氨氮濃度對發酵γ-PGA的影響

氮源作為菌體生長代謝的必需營養物質，能直接影響到發酵過程中氨基酸的代謝合成[21]。硫酸銨作為微生物發酵的速效氮源，是培養基中氨氮營養的合適補充者[22]。在分批發酵過程中，氨氮質量濃度一般會在42 h降至0.1 g/L以下。在控制培養基中葡萄糖濃度的同時，采用變速流加方式流加硫酸銨溶液，控制發酵液中氨氮濃度，以保障菌體生長發育和目標代謝產物積累。設計了維持氨氮濃度在0.1 g/L～0.5 g/L、0.5 g/L～1.0 g/L、1.0 g/L～1.5 g/L 3 種方法，結果見圖2。

圖2 維持不同氨氮濃度對發酵γ-PGA的影響Fig.2 Effects of maintaining different ammonia concentration on fermentation of γ-PGA

從圖2可以看出，不同氨氮濃度對OD660、谷氨酸濃度、γ-PGA產量影響較大。只補料葡萄糖，發酵結束時OD660為0.56，谷氨酸濃度為25 g/L，γ-PGA產量為（37.51±0.64）g/L；當維持氨氮濃度在 0.1 g/L～0.5 g/L、0.5 g/L～1.0 g/L，發酵結束時 OD660為 0.65、0.54，谷氨酸濃度為20 g/L和18 g/L，谷氨酸利用率較只流加葡萄糖提升了13.52%和18.93%，γ-PGA產量為（42.36±0.70）g/L 和（45.29±0.81）g/L，較只流加葡萄糖提高了12.93%和20.74%；當維持氨氮濃度為1.0 g/L～1.5 g/L，發酵結束時OD660為0.39，谷氨酸濃度為29 g/L，γ-PG產量為（31.71±0.65）g/L，較只補料葡萄糖均出現了明顯下降。

由圖2分析可知，隨著氨氮濃度逐漸提高，OD660、谷氨酸消耗量和γ-PGA產量均出現先升高后下降的情況。這表明將硫酸銨和葡萄糖搭配流加并維持其濃度在適宜范圍，有利于菌體生長發育和保持菌體胞內酶的活性，使得菌體增加了對底物的消耗利用，尤其谷氨酸利用率大幅增加，促進了γ-PGA的合成積累。但如果提供的氨氮量超過了菌體生長和產物合成所需，會對菌體的生長發育造成不同程度的抑制，使得菌種過早進入穩定生長期或者穩定生長期縮短提前進入衰亡期，這都會造成γ-PGA合成量下降。此外，氨氮的補充大大提高了菌體對底物谷氨酸的利用。綜上所述，當發酵液中氨氮濃度低于0.5 g/L時，通過流加硫酸銨溶液將氨氮濃度控制在0.5 g/L～1.0 g/L有利于γ-PGA發酵。

2.3 不同持續流加時間對發酵γ-PGA的影響

考慮到菌體對營養物質的需求量會因菌體所處生長階段不同而發生變化，探究了葡萄糖溶液和硫酸銨溶液的持續流加時間對發酵γ-PGA產量的影響，結果見表1。

表1 不同持續流加時間對發酵γ-PGA產量的影響Table 1 Effects of different duration on fermentation of γ-PGA

由表1所示，在發酵54 h前進行葡萄糖、硫酸銨溶液流加補料，使得OD660、谷氨酸消耗量、產量和生產強度隨著補料持續時間的延長而增加。持續流加葡萄糖、硫酸銨溶液12 h，發酵液最終OD660達到0.61，谷氨酸含量為17 g/L，γ-PGA產量為46.19 g/L，生產強度達到15.38 g/（L·d）。如發酵54 h后繼續流加葡萄糖溶液和硫酸銨溶液，會造成菌體量下降或菌體活性降低，對γ-PGA的合成積累沒有促進作用。

由表1可知，發酵培養54 h是地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.3336生長發育和積累γ-PGA的一個重要臨界點。持續流加葡萄糖、硫酸銨溶液12 h可以使菌種的指數生長期和穩定生長期得到不同程度地延長，且在穩定生長期時能保持一定的γ-PGA代謝活性，增加了底物谷氨酸的消耗轉化，合成積累更多γ-PGA；在54 h停止流加補料，發酵液中的葡萄糖和氨氮在后續發酵中被耗盡，避免了營養物質的浪費。適當的流加時間，不僅可以避免碳源和氮源提供過多對菌體生長發育和γ-PGA生產積累造成不利影響，還可以減少生產成本的增加。此外，發酵結束后，發酵液中的葡萄糖耗盡更有利于γ-PGA的提取純化[16]。因此，確定12 h為葡萄糖、硫酸銨溶液最適流加時間。

2.4 200 L罐放大驗證

為了驗證分批補料發酵條件優化后菌體發酵性能的穩定性，利用200 L發酵罐進行重復試驗，在200 L發酵罐中，加料量進一步擴大。200 L發酵罐生產γ-PGA各參數隨時間變化情況見圖3。

圖3 200 L發酵罐生產γ-PGA各參數隨時間變化情況Fig.3 The variation of γ-PGA parameters in 200 L fermentation tank with time

由圖3可以看出，在發酵過程中OD660、pH值、葡萄糖濃度、谷氨酸濃度、氨氮濃度、γ-PGA積累量的變化趨勢與5 L罐發酵基本一致，連續3次分批補料發酵均可穩定高產γ-PGA。菌體發酵72 h后，菌體OD660達到了0.62，較不補料發酵前提高了39.01%，谷氨酸利用率為77.14%，較不補料發酵提高了38.47%，γ-PGA產量為（47.09±0.82）g/L，較不補料發酵提高了38.45%。200 L罐發酵水平略優于5 L罐發酵，這可能是由于200 L發酵罐高徑比大于5 L發酵罐，增加了發酵液的傳質系數，提升了氧氣的利用率。這一結果驗證了在5 L發酵罐進行的分批補料優化成果，即通過分批補料流加方式對發酵液中葡萄糖和氨氮進行適宜補充和控制，能夠顯著提升菌體生長和γ-PGA合成。

3 結論

本研究分別以葡萄糖和硫酸銨作為碳源和氮源，采用變速流加方法補料，對發酵液中葡萄糖濃度和氨氮濃度的控制范圍以及持續控制時間進行優化。試驗結果表明，當培養基中葡萄糖濃度低于5 g/L，氨氮濃度低于0.5 g/L時開始流加補料。在200L發酵罐中，葡萄糖濃度控制在5 g/L～15 g/L，氨氮濃度控制在0.5 g/L～1.0g/L，持續控制12 h進行γ-PGA分批補料發酵，菌體的指數生長期延長了6 h，菌體量明顯提升，發酵72 h結束時OD660達到了0.62，并且菌體處于穩定生長期仍合成大量γ-PGA，谷氨酸濃度降至了16 g/L，γ-PGA生產強度達到了15.69 g/（L·d），最終發酵液中γ-PGA產量達到了（47.09±0.82）g/L。相對于不補料發酵，菌體量提升了39.01%，谷氨酸利用率提高了38.47%，γ-PGA生產強度和產量均提高了38.45%。這一結果對實現γ-PGA高效發酵具有借鑒意義。