酵母β-葡聚糖提取方法及免疫活性研究

吳豪益，王彥波，傅玲琳，劉福奇，韓軍花

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018；2.浙江工商大學實驗室與資產管理處，浙江 杭州 310018；3.美贊臣嬰幼兒營養品研發中心（中國）有限公司，廣東 廣州 510623）

β-葡聚糖是一類天然多糖，由D-葡萄糖單體通過β-糖苷鍵連接而成，作為細胞壁的重要結構元件，在細菌、真菌（包括酵母）、藻類和植物中廣泛存在。研究發現，β-葡聚糖的理化性質及生物活性均與其分子空間結構密切相關[1]。不同來源的β-葡聚糖以及不同的提取、純化方法都會影響其分子結構，進而影響相應的生物活性[2-3]。研究顯示，來源于啤酒酵母的酵母β-葡聚糖（yeast β-glucan）在 β-1，3 主鏈上有高度支鏈度，分子量比較大。并且其表現出增強機體免疫能力、調節血糖和腸道微生態的生理作用，因此被認為是一種安全天然有效，具有免疫調節的功能食品原料[4]。

酵母β-葡聚糖在2008年獲得美國食品藥品管理局的食品安全性認證（Generally Recognized as Safe，GRAS）（GRN00239），隨后常被用于支持健康免疫功能的功能性食品、飲料、保健食品和運動營養產品。中國衛生部發布的《中華人民共和國衛生部公告2010年第9號》公告，認定酵母β-葡聚糖為新資源產品，可以添加到乳制品、功能飲料、焙烤制品、糖果等各種食品中。2012年第6號公告已將酵母β-葡聚糖使用范圍擴大至嬰兒配方乳粉，本文為其在食品領域的發展和應用提供了參考。

1 酵母β-葡聚糖的制備

1.1 酸堿法

酸法和堿法是最早應用于酵母β-葡聚糖浸提的方法之一。在早期的研究中，一般使用醋酸、甲酸等有機酸在90℃左右的條件下對酵母細胞水浴3 h左右，再經過離心、沉淀以及干燥等操作得到酵母β-葡聚糖產物[5-6]。黃丹等[7]研究發現，使用酸法得到的產物雖然產率較高（21.58%），但是純度較低，雖然經過一系列的優化但純度（71.46%）仍無法提高到理想程度。而在對堿法提取的研究中，使用NaOH處理酵母細胞，并輔以高壓等手段，使所得產品純度達到90%以上，滿足食品以及醫療等領域的要求。但堿法過程中產生的廢液難以處理，限制了其在大規模生產中的應用[8-9]。為將酸堿兩種提取方式的優勢結合起來，于明秀和Pengkumsri等[6，10]對酸堿結合的方法進行探究及優化，將酵母細胞自溶后，先后用強堿（NaOH）和弱酸（CH3COOH）處理，所得的酵母β-葡聚糖產品的得率和純度都較單獨處理的酸法和堿法有提升，且產品改性后能滿足醫療領域的需求。但是由于酸堿廢液的環境污染問題仍然無法達到有效的改善，且由于過程中使用大量的酸堿造成提取成本的增加。因此，酸堿法處理無法滿足目前食品以及藥品市場對酵母β-葡聚糖的需求，也無法滿足市場對綠色生產的要求。

1.2 高壓微射流均質法

高壓微射流均質法（high pressure microfluidization，HPM）作為一種比較新興的食品加工處理手段，在酵母β-葡聚糖提取的應用中也表現出良好的效果。HPM利用高壓使液體物料被泵入并分成兩個微流，隨后在一個反應腔室發生相互碰撞，使微粒受到強烈的剪切、撞擊及空穴效應，使得細胞破碎、內容物溢出，實現對細胞內化合物的高效提取[11-12]。Williams等[13]用HPM技術從釀酒酵母中提取β-葡聚糖，在保持其生理活性的同時能夠顯著降低其分子量，獲得溶解度更好的高品質產品。Liu等[14]對HPM過程中的最佳處理條件進行探索，發現隨著HPM壓力升高可以明顯提高可溶性β-D-葡聚糖的產量，在壓力達到165.48 MPa時，提升效果最佳。在腔室壓力為165.48 MPa、停留時間為10 min/200 mL的條件下制得的β-葡聚糖產品不僅產量和純度優于傳統酸堿浸提法，且可溶性更佳，蛋白質含量更低，適用于產業化生產[15]，HPM技術與其他方式優化組合后，較單一的提取方法在提取效率、得率和純度上顯著提高。高潔等[16]在前期研究的基礎上，采用高壓微射流均質與復合酶解結合的方法制備酵母β-葡聚糖，見圖1，高壓微射流1處理條件：壓力210 MPa、循環3次、質量濃度20%（濕重）；復合酶解條件：酶添加量1.0%、溫度55℃、pH7.0、酶解50 min、料液比濕重（質量比）1∶4；高壓微射流2處理條件：壓力210 MPa、循環3次，制得的酵母β-葡聚糖產物純度為（81.07±0.82）%，總糖含量為（91.51±1.60）%，基本可以達到工業化生產的純度和得率要求。但是可能由于過程中的高壓環境使得酵母的立體結構被破壞，得到的酵母β-葡聚糖產物為粗糙扁平狀，這對葡聚糖的功能效果可能會產生一定的影響。

圖1 高壓微射流均質與復合酶解結合方法Fig.1 The method of combining HPM and compound enzymatic hydrolysis

1.3 超聲波法

目前，超聲波技術作為一種非熱加工技術，由于其空化效應能夠有效地增強物質的提取分離效果，作為一種輔助提取手段在對天然產物和生物活性物質的提取中表現出巨大的潛力[17]。早期研究采用超聲波技術處理酵母泥，多糖得率能夠達到33%～36%，遠高于傳統酸堿法20%左右的多糖得率。在此基礎上，李紅梅等[18]利用Box-Behnken優化超聲波輔助提取技術中的關鍵因素，如處理時間及超聲功率，采用的自溶超聲波耦合技術在提取酵母β-葡聚糖時提取率達到50.5%。自溶超聲耦合技術在超聲技術的基礎上利用酵母細胞在特定環境下的自溶，破壞細胞結構，與超聲輔助提取效果起到協同效果。Zheng和Kim等[19-20]發現，超聲波處理與堿處理分別使酵母β-葡聚糖的粒徑從 8.80 μm 減少到 1.77 μm 和 7.19 μm，相比于堿處理，超聲波處理在松動葡聚糖聚集結構，擴大比表面積，增強其可溶性方面有更大的優勢。當超聲波技術與酶解相結合處理時，前者通過增大酶接觸面積大大增強了酶解效率，使酵母β-葡聚糖的產率提高到32.3%，純度達到98.8%，遠超于單一處理模式[21]。超聲與上述輔助手段的聯合處理得到的酵母β-葡聚糖產物在結構和生物活性保留上有較大的改善。可見，這類提取方式是酵母β-葡聚糖在工業中高效提取的潛在方法。

2 酵母β-葡聚糖免疫活性

2.1 基于細胞模型研究

在體外研究中，酵母β-葡聚糖表現出對免疫細胞、受體及細胞因子等參與免疫系統因子的調節作用。Angulo等[22]利用酵母β-葡聚糖刺激山羊的單核細胞，在培養4 d～6 d后，表現出典型的巨噬細胞形態，且上調了巨噬細胞表面標志物（CD11b和F4/80）的基因表達，從而在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）攻擊下發現了增強的細胞存活和高吞噬能力。在前期的一些研究中發現，酵母β-葡聚糖在體外表現出促進脾臟淋巴細胞增殖的作用，且有助于白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-10（interleukin-10 IL-10）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-17A（interleukin-17A，IL-17A）等細胞因子的產生[23-24]，對免疫效果有顯著的增強作用。此外，在已有的研究報道中，酵母β-葡聚糖表現出與抗腫瘤單克隆抗體的協同作用，對抗腫瘤效果及多種凋亡調節蛋白水平有顯著的改善。酵母β-葡聚糖可以直接抑制癌細胞的生長，也可以刺激自然殺傷細胞或中性粒細胞在與葡聚糖受體結合時殺死癌細胞[25]。在近期研究中發現，酵母β-葡聚糖作為一種新型的自噬抑制劑在癌癥治療方面取得了進展，其通過增加溶酶體pH值和抑制溶酶體組織蛋白酶活性來抑制自噬降解，從而對肝癌細胞的增殖和代謝以及體內腫瘤的生長表現出顯著的抗腫瘤作用[26]。

2.2 基于動物模型研究

目前酵母β-葡聚糖在很多動物試驗研究中表明，其在提高機體免疫能力、抗腫瘤等方面有顯著的效用，被用作動物免疫刺激劑。Wang等[27]在研究中發現，口服硫酸化的酵母β-葡聚糖通過顯著改變細胞因子的濃度，提高 γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和 IL-6濃度，降低轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）濃度，促進淋巴細胞增殖從而有效改善雞的免疫系統，同時增加有益的腸道細菌，促進腸道免疫系統的功能。利用口服插管方式對鰨魚模型進行酵母β-葡聚糖給藥，通過取血分析和對魚腸道菌群的16S rDNA組學測序，結果表明魚腸道IL1B和IRF7表達上調且腸道微生物中的弧菌比例顯著降低，實現對模型免疫的調節[28]。并且當酵母β-葡聚糖作為補充物添加于飼料中時，能夠有效提高養分消化率，通過增加免疫球蛋白濃度和刺激堿性磷酸酶來增強免疫力[29]，在提高機體先天性免疫力和特異性病原體抵抗力方面體現了良好的應用前景。在小鼠模型的研究中發現，酵母β-葡聚糖能夠有效預防小鼠單增李斯特菌、炭疽芽孢桿菌以及白色念珠菌的感染[30-31]。Chan等和Alexander等[32-33]基于之前所報道的抗腫瘤機制，證明了酵母衍生的β-葡聚糖顆粒在小鼠肺部轉移樣黑色素瘤模型中的抗腫瘤功效。近期有研究表明，酵母β-葡聚糖與鋅復合后的產物在納米載體遞送下對機體的抗炎和促炎細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8）有明顯的增強作用，對提高機體體液免疫、自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）活性，增強腸黏膜免疫有顯著調節作用[34-35]。

2.3 基于臨床研究

近年來，酵母β-葡聚糖在臨床人體免疫方面的應用也受到學者的關注。研究表明，針對不同年齡階段人群的雙盲選實驗中，攝入酵母β-葡聚糖的受試人群較安慰劑對照人群，皮膚和呼吸道的過敏癥狀等發生率有顯著降低[36-38]。尤其在幼兒期方面以及中老年人方面表現出顯著的提高機體免疫力的效果，在對1歲～4歲兒童的喂食實驗中，攝入含酵母β-葡聚糖乳品飲料的實驗組受試結果顯示其過敏性鼻炎、喘息，過敏性咳嗽、濕疹和蕁麻疹等發生率與對照組相比有顯著降低且需要接受抗生素治療的比例減少[39]。Fuller等[36]在針對50歲～70歲中老年人范圍的研究中發現，每天服用250 mg酵母β-葡聚糖膠囊雖然沒有顯著的統計學差異，但是能夠有效降低發生感染癥狀的天數，同時改善情緒狀況，緩解情緒壓力。但是對于酵母β-葡聚糖在人體中調節的具體機制還不清晰，待進一步的研究。

2.4 免疫活性機制

酵母β-葡聚糖由于其顯著的免疫調節作用而受到廣泛的關注，酵母β-葡聚糖免疫活性機制見圖2。酵母β-葡聚糖進入消化道后，通過食道和胃進入小腸。在腸壁上的M細胞將β-葡聚糖從腸腔轉運到淋巴組織[40]，該區域富含免疫細胞，例如巨噬細胞和樹突狀細胞，可連續監測通過腸道的成分，尤其是有害微生物。巨噬細胞和樹突狀細胞在其外表面具有專門的受體，可以識別并結合有害微生物中常見的分子結構[41]。以巨噬細胞為例，由于酵母β-葡聚糖分子特殊結構，會被巨噬細胞上的受體識別后結合，并由此激活巨噬細胞，并使其具有破壞有害微生物的能力[42]。小鼠體內實驗顯示，喂養酵母β-葡聚糖的個體內粒細胞和單核細胞具有更高的吞噬活性及吞噬細胞的百分比[40]，可見酵母β-葡聚糖對這些細胞類型的氧化代謝產生了積極的作用，這是一種強烈的呼吸爆發刺激。利用致敏蛋白刺激淋巴細胞時，來自酵母β-葡聚糖喂養組的淋巴細胞具有較高的增殖率[43]，這也證明了酵母β-葡聚糖對細胞免疫的積極影響。此外，盡管酵母β-葡聚糖開始在腸道中發揮作用，但也有研究表明，酵母β-葡聚糖分子可以被巨噬細胞轉運至體內其他部位的淋巴組織，從而可以激活其他免疫細胞[40]。而由于酵母β-葡聚糖被免疫細胞上受體所識別并結合是具有專一性的，因此具有不同分子結構的β-葡聚糖在免疫系統的作用也不同，具體的免疫機制仍需要進一步的探索。

圖2 酵母β-葡聚糖免疫活性機制Fig.2 Yeast β-glucan immune activity mechanism

3 結論與展望

目前，酵母β-葡聚糖在化工、水產以及食品方面的應用受到越來越廣泛的關注。調查數據顯示，到2022年，全球酵母β-葡聚糖市場將達到4.765億美元，這表明β-葡聚糖的應用具有巨大的發展潛力。但是在國內市場中，酵母β-葡聚糖仍然存在產量低、品質不高等問題，無法滿足市場日益增長的需求。目前常用的提取手段包括酸堿法提取、高壓微射流均質法以及超聲輔助提取法，這些方法都還存在產率低、純度難以滿足市場需求、生產過程污染嚴重等問題。尋找一種工藝簡單、產量高且產品質量良好的生產方式有助于提高酵母β-葡聚糖商業價值，推廣其在各領域的應用，順應其國際發展趨勢。目前在細胞模型、動物模型和初步臨床上對酵母β-葡聚糖進行了一系列研究，β-葡聚糖均表現出了提高機體免疫能力的作用。但是其對機體免疫調節的具體機制還存在一些疑問，某些提出的機制仍基于假設，尚未闡明潛在的作用機制。未來的研究應集中在探索酵母β-葡聚糖與不同主體之間的深層相互作用機制，以及不同機制之間的相互聯系。這對于了解人和動物中酵母β-葡聚糖引起的變化將是有益的，這也將有助于酵母β-葡聚糖的開發和應用。