基于GC-O-MS結合化學計量學探究紫蘇對魚腥味的抑制作用

吳天樂，詹萍，王鵬

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119）

紫蘇[Perilla frutescens（L.）Britt.]是一種唇形科“藥食同源”性草本植物，富含α-亞油酸、多酚、維生素（β-胡蘿卜素）和礦物質，具有心腦血管保健、抗炎抑菌以及增強免疫力等生物活性功能[1]。近年來對紫蘇的相關研究包括紫蘇功能性評價（如抗炎、抗腫瘤和抗氧化等）[2-3]、紫蘇揮發/非揮發性物質分離與鑒定[4-6]等領域。然而利用紫蘇及其天然提取物作為抑制魚肉中魚腥味手段的相關研究鮮有報道。

魚肉因脂質氧化[7]（酶促氧化[8]、非酶氧化[9]）會產生魚腥味等不良風味，而強烈的魚腥味會嚴重降低魚肉的感官品質，制約其在食品中的應用以及消費者的購買欲望。相關研究表明，部分濃度高、氣味閾值低的醛類和醇類等化合物對魚肉不良風味產生起重要作用[10]，如郝淑賢等[11]發現己醛、庚醛、辛醛、2-辛烯醛、壬醛、2-壬烯醛、癸醛、2，4-壬二烯醛、2-十一烯醛以及2，4-癸二烯醛等使羅非魚產生魚腥味和哈喇味等不良風味；此外，楊倩倩等[12]通過對比養殖大黃魚脫脂除臭處理前后的揮發性成分，認為己醛、2，4-癸二烯醛、1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-酮和 3，5-辛二烯-2-酮是魚腥味的主要成分；An等[13]研究結果再次證實淡水魚魚糜樣品中（E，Z）-2，4-癸二烯醛是造成魚肉腥味和油脂味的關鍵揮發性物質。

吸附法、有機溶劑萃取法、抗氧化法等是目前主要應用的除腥手段[14]，隨著自然健康理念的普及，利用天然食材及其產物除腥逐漸成為除腥手段發展趨勢。如通過浸漬預處理的丁香水提取物用于干制歐梅納魚（Rastrineobola argentea），能夠顯著降低其硫代巴比妥酸反應物值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）和過氧化值等脂質氧化指標[15]；利用柑橘精油可顯著抑制鱸魚魚片中病原菌和真菌菌群的生長[16]，或是采用牛至精油（0.8%）[17]、百里香精油（1%）和月桂精油（1%）[18]也可改善魚肉的感官品質。此外，酚類化合物能夠與蛋白質等多種食品成分發生化學反應，或與一些氣味揮發性化合物直接反應，從而改變產品風味[19-20]，如葡萄多酚已經被證明能抑制冷凍魚糜中的脂質氧化[21]，并能保護脂肪魚的內源性抗氧化系統[22]；同樣，茶多酚能有效抑制氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）的分解，抑制脂質的氧化，并能有效保持魷魚干的風味品質[23]。

紫蘇傳統食用形式通常是作為調味品煲湯或涼拌，湖南名菜紫蘇燉魚就是將紫蘇和魚一同煮制，從而達到抑制魚腥味、提升鮮味的目的。同時已有相關研究將紫蘇或其提取物用于魚肉及其制品，如陳奇等[24]發現利用紫蘇液腌制的魚制品質量顯著提高；周偉等[25]指出紫蘇葉水提取物能有效抑制鰹魚貯藏過程中的脂質氧化和腐敗微生物的生長，但針對采用新鮮紫蘇探究對魚肉腥味物質抑制的研究鮮有報道。因此基于感官組學與化學計量學統計分析，探究紫蘇除腥效果并從分子層面科學揭示除腥機制，對紫蘇產業深加工形式拓展以及產業鏈延伸具有重要意義。

本研究采用氣相色譜-嗅聞-質譜聯用（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）技術分離與鑒定魚肉中揮發性物質組成，并通過嗅辨確定魚肉中關鍵呈腥味特征物質；再向魚湯中添加不同質量的紫蘇粉，通過GC-O-MS、感官評價結合主成分分析（principal component analysis，PCA）等，構建腥味物質與感官屬性相關性預測評價模型，在明晰魚肉中特征腥味物質的基礎上，評價紫蘇對腥味的抑制作用，以期為采用天然產物抑制魚肉腥味提供參考，同時為紫蘇資源深加工利用提供新思路與技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮草魚、干紫蘇葉（產于廣西南寧）：市售；1，2-二氯苯（純度＞99%）、正構烷烴（C7～C40）：美國 Sigma公司。

1.2 儀器與設備

手提式高速中藥粉碎機（DFT-100）：江蘇同君儀器科技有限公司；電子分析天平（MA110）：上海第二天平儀器廠；高壓反應瓶：上海有機化學研究所；焦熱式恒溫磁力攪拌器（DF-101S）：河南予華儀器有限公司；固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）裝置（75 μm CAR/PDMS萃取頭）：美國Supelco公司；氣相色譜質譜聯用儀（5977B-7890C）：安捷倫科技有限公司；嗅辨儀（Olfactry Port OP275）：荷蘭 ATAS＆GL公司。

1.3 方法

1.3.1 魚湯樣本制備

將新鮮草魚經宰殺、去鱗、清洗等預處理，沿魚背部剖開，除去內臟、頭部和尾部并切成大小接近的魚塊（4 g/塊），準確稱取6份樣品（8 g/份）。將干紫蘇葉粉碎過40目篩制得紫蘇粉。將魚塊放入100 mL高壓反應瓶，按照魚塊質量0%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、5.00%的比例將紫蘇粉依次加入到反應瓶中，形成梯度樣本S0～S5，加入40 mL蒸餾水，將反應瓶置于焦熱式恒溫磁力攪拌器中油浴，于120℃加熱50 min，待進一步檢測。

1.3.2 感官評價方法建立

采用定量描述分析（quantitative descriptive analysis，QDA）方法進行評價[26]，根據現有魚湯風味描述[27]結合評價小組成員討論，形成魚湯感官屬性的描述詞，最終確定感官屬性描述詞為哈喇味、魚腥味、脂香味、肉香味、草藥味、清香味[28]，各屬性均采用100分制評價，從0到100分別表示氣味強度從無到有且依次增強（0為未感知到），感官評價評分標準見表1。

表1 感官評價評分標準Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation

將6組不同的魚湯樣品進行隨機三位數編號，通過培訓的10名感官品評人員（5男5女，平均年齡在25歲）進行嗅聞打分。

1.3.3 GC-O-MS檢測條件

揮發性物質萃取：將萃取頭在氣相色譜進樣口進行空白解吸，老化30 min，待基線平穩。向反應瓶加入1.0 μL 的標準品 1，2-二氯苯（濃度為 0.130 6 μg/μL）作為內標化合物；將反應瓶置于60℃水浴鍋中，平衡10 min，插入萃取頭，頂空萃取40 min。萃取完成后，迅速插入氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀進樣口，啟動GC-O-MS進行數據采集，萃取頭解吸時間7 min。

升溫與嗅聞條件：選用DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm）；進樣口溫度為 250℃；柱箱升溫程序為初始溫度40℃，保持3 min，以5℃/min的速率升至200℃，保持5 min，最后以10℃/min的速率升至230℃，保持5 min；載氣為高純氦氣，流量為1 mL/min；進樣分流比為2∶1，溶劑延遲5 min。在分流閥處補充氦氣，柱箱和嗅辨儀間的傳輸線溫度設置為120℃，在嗅探口用水蒸氣增濕氣體，流量1 mL/min[29]。嗅聞分析采用檢測頻率法（detection frequency，DF）[30]，感官小組成員記錄氣味活性化合物開始和結束時間并進行氣味描述，每個小組成員重復2次，DF≥5的化合物（至少有5名評估員報告）可被視為具有氣味活性。

MS條件：離子化方式為電子電離（electron impact，EI），電子能量 70 eV，離子源溫度 230 ℃，四極桿溫度150℃，質量掃描范圍35 amu～750 amu。

1.3.4 揮發性物質定性與定量

定性方法：將各分離組分的質譜信息與Wiley library和NIST 14 library中已知化合物的質譜信息相匹配，選取相似度指數大于800的鑒定結果，并與文獻資料中已報道的線性保留指數（linear retention indices，LRI）進行比對[31]，按如下公式計算化合物保留指數（retention index，RI）。

式中：tRx為待測化合物x的調整保留時間，min；tRn為碳原子數為n的正構烷烴調整保留時間，min；tR（n+1）為碳原子數為n＋1的正構烷烴調整保留時間，min；n為碳原子數。

定量方法：采用內標法定量[32]，通過魚湯中各待測組分的峰面積和內標物的峰面積比值，按如下公式計算各個組分的相對含量。

式中：Ci為待測組分 i的含量，mg/g；Ws為加入內標s的質量，mg；Ai和As分別為待測組分i和內標化合物s的峰面積；m為待測樣品的質量，g；fi′為待測組分i對內標s的相對質量校正因子；本試驗中各待測組分i的相對校正因子均為1。

1.4 數據處理

聚類分析、方差分析和主成分分析均采用SPSS 19.0軟件處理，所有試驗均進行3次，所有數據均以平均數±標準差呈現。

2 結果與分析

2.1 不同紫蘇添加量樣品中揮發性成分分析

經過GC-MS檢測，不同紫蘇添加量的魚湯中揮發性成分如表2所示。

表2 不同紫蘇添加量的魚湯揮發性成分匯總與嗅辨描述Table 2 Volatile compounds extracted from fish soup added with Perilla frutescens leaves and olfactory description

續表2 不同紫蘇添加量的魚湯揮發性成分匯總與嗅辨描述Continue table 2 Volatile compounds extracted from fish soup added with Perilla frutescens leaves and olfactory description

由表2發現，紫蘇不同添加量會造成魚湯整體揮發性物質構成產生明顯差異，為進一步探究紫蘇對魚湯中呈味物質影響，首先采用GC-O嗅辨分析確定具有呈味效果的物質，發現己醛、庚醛、2-戊基呋喃、辛醛、（E）-2-庚烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇、癸醛、（E）-2-壬烯醛、芳樟醇、石竹烯、（E）-2-辛烯-1-醇、（E）-2-癸烯醛、α-松油醇、紫蘇醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛、（E）-紫蘇醇17種物質可嗅辨出明顯氣味。結合相關研究證明由于多不飽和脂肪酸通過脂氧合酶（如1，5-脂肪氧合酶、1，2-脂肪氧合酶）可以衍生出短鏈碳醇和羰基化合物，因此醛類通常在魚肉中呈現油脂味或脂香味[33]，如辛醛、壬醛、（E）-2-壬烯醛和（E，E）-2，4-癸二烯醛；己醛偏青草味，庚醛則帶有魚腥味[34]；此外，呋喃類物質一般是由碳水化合物降解、美拉德反應或脂肪氧化等途徑產生，魚湯中的2-戊基呋喃主要由脂肪氧化產生[35]。嗅辨得出魚湯主要呈香特征為土腥味、油脂味和青草味，初步推測己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、（E）-2-壬烯醛、2-戊基呋喃、（E）-2-辛烯-1-醇、（E）-2-庚烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛和（E）-2-癸烯醛等是潛在構成魚腥味的關鍵物質。

以純魚湯為對照組，將紫蘇以不同添加量加入魚湯后，由于紫蘇中揮發性物質加入，紫蘇魚湯的整體揮發性物質種類與含量均顯著變化，對比發現11種具有潛在魚腥味揮發性特征物質在紫蘇添加后均呈顯著降低趨勢，如隨著紫蘇添加量增加，庚醛含量從（6.15±0.43）μg/g降低至（0.69±0.05）μg/g，（E，E）-2，4-癸二烯醛與庚醛趨勢相同，含量從（15.31±1.06）μg/g降低至（1.90±0.14）μg/g，具有青草味的己醛和 2-戊基呋喃含量也發生了降低，分別隨著紫蘇添加量增加從（15.76±1.10）μg/g降低至（1.71±0.12）μg/g以及從（16.04±1.12）μg/g降低至（2.15±0.16）μg/g。在 11 種特征物質中壬醛下降最為明顯，純魚湯含量為（37.89±2.64）μg/g，在添加 5%紫蘇后降至（1.06±0.08）μg/g。以上結果表明，紫蘇的添加造成了魚湯整體物質組成變化，可明顯降低關鍵呈腥味揮發性物質的含量，并不僅僅是掩蓋原有的魚腥味，而是發生了化合或分解等化學變化[36]。此外，紫蘇的添加也使魚湯揮發性物質組成中產生多種具有其他呈香屬性的揮發性物質，如紫蘇醛（草藥味）、（E）-紫蘇醇（清香味）和芳樟醇（香甜味）等在純魚湯中未檢測出，在紫蘇添加量為5%時分別達（214.29±15.45）、（18.69±1.35）μg/g 和（25.76±1.87）μg/g，以上“從無到有”的物質在一定程度上改變了魚湯整體風味輪廓，然而魚湯或紫蘇魚湯揮發性物質組成復雜，難以直接通過對比其含量高低評價紫蘇添加是否對魚湯風味品質產生正向調控，以及不同梯度添加是否產生差異，因此以揮發性物質含量為數據源，采用聚類分析對6組樣本組間差異進行分析。

2.2 不同紫蘇添加量樣品聚類分析

不同紫蘇添加量的魚湯聚類分析如圖1所示。

圖1 魚湯揮發性風味物質聚類分析Fig.1 Cluster pedigree of volatiles from fish soup

由圖1可知，6組不同紫蘇添加量魚湯樣本（S0～S5）在歐式組間距離為5時，分為三大組。第一大類的3組魚湯樣本分別為空白對照和紫蘇添加量較低的兩組（S1為0.05%、S2為0.10%），它們在最小距離內形成聚類，表明這幾組樣本相似性較高[37]，在歐式距離為2時S3與S4歸為一類，隨著歐式距離增大到6時S0～S4產生聯系。而當歐氏距離繼續增加至25時，S5才與其余樣本歸為一類。由聚類分析結果進一步說明紫蘇的添加會造成魚湯整體風味輪廓產生顯著差異，并且隨著紫蘇的添加紫蘇魚湯組間也會產生明顯差異，在紫蘇添加量低于0.10%時與純魚湯相比整體揮發性風味物質輪廓未產生顯著變化，表明對魚湯除腥效果并不明顯，隨著紫蘇添加量增至0.50%和1.00%產生差異效果，直至添加量為5.00%時差異最大。然而，并不是紫蘇添加量越多對魚湯除腥效果越佳，需要結合人工感官評價對魚湯各感官屬性進行評價，綜合得出紫蘇對魚湯整體風味品質影響效果，從而確定最佳除腥效果的紫蘇添加量。

2.3 不同紫蘇添加量魚湯感官評價與主成分分析

對不同紫蘇添加量的魚湯進行感官評價，評分結果如表3所示。

表3 不同紫蘇魚湯樣本描述性感官評分Table 3 Descriptive sensory profiles of fish soup samples added with different amounts of Perilla frutescens leaves

對不同樣本各感官屬性進行差異對比，發現添加紫蘇后魚湯各感官屬性均發生改變，不僅體現在腥味屬性的得分降低，而且隨著紫蘇的加入其帶來的感官屬性強度也隨著增加。在純魚湯中魚肉天然帶有的哈喇味和魚腥味感官強度為所有試驗組中最強，在紫蘇添加量較低如S1和S2樣本中，這兩種感官屬性并未發生顯著差異（P＞0.05），因此說明此時紫蘇添加量不足以達到較好的除腥效果，對魚湯整體風味品質改善不明顯。隨著紫蘇添加量的增加從S3樣本到S5樣本兩種感官屬性均顯著降低（P＜0.05），同時草藥味感官強度顯著增強，表明紫蘇添加過量雖然除腥效果有所增強，但會帶來其他風味，甚至會產生令人不愉悅的氣味，以致對魚湯整體風味品質起到劣變作用，對比S4與S5樣本發現魚肉的魚腥味屬性并未進一步降低，但草藥味屬性卻顯著增加（P＜0.05），再次證明紫蘇添加過量會使草藥味過大從而對魚湯整體風味品質產生負面影響。為進一步明晰造成魚腥味等不良風味的揮發性物質，以及從分子層面揭示紫蘇添加量與感官屬性間內在聯系，采用主成分分析構建不同紫蘇添加量中揮發性物質與感官屬性得分相關性評價模型，不同魚湯樣本PCA載荷圖如圖2所示。

圖2 不同魚湯樣本PCA分析載荷圖Fig.2 PCA plot of different fish soup samples

由圖2可知，PC1和PC2累計總方差貢獻率為83.23%，符合主成分構建規則，能夠反映各組樣本大部分信息，選取前兩個主成分（PC1、PC2）分析。PCA分析基本原則為在圖中距離越近表明潛在相關性越大，6種感官屬性分布于坐標系3個象限，其中清香味與草藥味集中在坐標系左側，該結果驗證了清香味與草藥味是由于紫蘇的添加引入，因此二者含量變化存在顯著相關性。脂香味與肉香味分布在坐標系右下方且距離接近，說明這兩種感官屬性變化存在顯著相關性，且均為正向感官屬性，符合實際感官評價體驗。在無監督分析模式下通過二維空間的距離可以分析出各揮發性物質與感官屬性的相關性大小[38]，基于此可推斷與腥味及哈喇味相關性高的物質。由圖2可知，庚醛（A10）和（E，E）-2，4-癸二烯醛（A67）緊密聚在魚腥味屬性周圍，2-戊基呋喃（A11）、壬醛（A24）、癸醛（A34）、（E）-2-辛烯-1-醇（A51） 和（E）-2-癸烯醛（A53）聚在哈喇味屬性周圍，證明這7種物質與魚湯中魚腥味和哈喇味兩種感官屬性成顯著相關性，同時也證明此模型能夠有效篩選出表征各感官屬性的關鍵物質。此外，在通過嗅辨確定的11種物質中己醛（A5）、辛醛（A17）、（E）-2-庚烯醛（A20）和（E）-2-壬烯醛（A38）這4種物質在PCA模型中并不與采用GCO-MS嗅辨確定的各對應感官屬性接近，這是因為PCA無監督分析模式依照含量與感官屬性強度間是否存在對應關系而進行分類，而以上4種物質的含量在添加紫蘇后，與魚腥味或哈喇味感官屬性強度間并不存在線性或非線性變化，因此與其他7種物質相比相關性較低，同時有多種物質在GC-O-MS嗅辨過程中未呈現特征氣味，但與各感官屬性距離接近，可能是因為這些物質含量改變與感官屬性變化成顯著正或負相關，這些高相關性物質也可作為后期預測除腥效果或感官品質靶點物質。

3 結論

采用GC-O-MS技術對不同紫蘇添加量魚湯中揮發性物質分離與鑒定，并通過嗅辨儀篩選出11種潛在關鍵魚腥味組成物質，分別為己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、（E）-2-壬烯醛、2-戊基呋喃、（E）-2-辛烯-1-醇、（E）-2-庚烯醛、（E，E）-2，4-癸二烯醛和（E）-2-癸烯醛。添加紫蘇使11種呈腥味特征物質含量降低，同時如紫蘇醛、（E）-紫蘇醇等物質含量增加。通過聚類分析確定添加紫蘇能夠顯著改變魚湯揮發性風味物質輪廓，同時對6組魚湯進行感官評價，對6種感官屬性強度評價發現紫蘇添加量在0.50%時魚腥味感官屬性強度最低，且不會隨著紫蘇增加再繼續降低，同時紫蘇添加量達5.00%時魚湯中草藥味屬性強度過高，會造成魚湯整體風味品質劣變，最后采用PCA驗證了前期嗅辨中7種關鍵物質為構成魚腥味和哈喇味的特征物質。綜上所述，添加紫蘇能夠通過降低關鍵呈腥味物質含量達到除腥目的，然而紫蘇添加需適量否則會產生新的不良風味，后期可進一步以關鍵呈腥味物質為靶點定向優化紫蘇除腥工藝、深入探究除腥機理。