銀杏黃酮對心肌缺血/再灌注損傷的保護作用

騫秀芳，孫會仙，王 晨，陳 瑩

目前，心腦血管疾病已成為我國居民死亡的主要原因之一，尤其是缺血性心臟病，呈逐年上升趨勢。早期快速開通阻塞的冠狀血管，給予再灌注治療是改善心肌缺血的關鍵環節；伴隨再通的冠脈血流，心肌會再次受損，稱之心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)。銀杏黃酮(ginkgetin, GK)為藥用植物銀杏(Ginkgo biloba L.)葉片的活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、降血脂、神經保護等多種藥理效應，同時具備較好的安全性。近年來國內外學者實驗研究發現，GK有助于改善MIRI受損的心肌組織，但其具體環節仍不明確。本研究從心肌細胞凋亡角度入手，通過構建MIRI大鼠模型，探討GK對MIRI的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 選取SD大鼠48只，雌雄各半，體重(200±20)g，由北京科宇實驗動物養殖中心提供[許可證號：SCXK(京)2018-0010]。飼于動物房屏蔽環境，溫度20～23 ℃，相對濕度60%～70%，明暗光照分別為12 h。所有動物相關操作規程均經武警北京總隊醫院動物倫理委員會批準認可。

1.2 藥品與試劑 GK(黃酮含量≥24%)購自徐州峻源銀杏制品有限公司，實驗前以1%二甲基亞砜(DMSO)配成濃度2%、1%的溶液。氯化硝基四氮唑藍(NBT)、碘化丙啶(PI)，采用美國Amresco公司產品。半胱氨酸蛋白酶蛋白(caspase)-3、caspase-8活性檢測試劑盒(熒光法)，美國Clontech公司產品。Trizol試劑、反轉錄試劑盒及實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒，美國Applied Biosystems公司產品。凋亡因子Fas、Fas-L及內參β-actin等引物均由上海生工生物工程股份公司設計并合成。

1.3 儀器設備 ECG-2360型十二導聯心電圖機，上海光電醫用電子儀器有限公司產品；DHX-500型動物人工呼吸機，北京金洋萬達科技有限公司產品；PT2500E型高速勻漿儀，瑞士Kinematica公司產品；CKX41型光學顯微鏡，日本Olympus公司產品；醫學圖像分析系統，北京環中睿馳科技公司產品；FACS101型流式細胞儀，美國Becton Dickinson公司產品；SpectraMax iD3型熒光酶標儀，美國Molecular Devices公司產品；Mx3000P型實時熒光定量PCR儀，美國Agilent 公司產品。

1.4 分組與預處理 將大鼠隨機分為假手術組(等體積1% DMSO)、模型組(等體積1% DMSO)、GK高劑量組(200 mg/kg)、GK低劑量組(100 mg/kg)，每組12只。造模術前7 d開始腹腔給藥，1次/d，造模術前30 min再給藥1次。

1.5 MIRI模型的建立 采用冠脈左前降支結扎術造模。大鼠麻醉后仰位固定于手術臺上，連接動物呼吸機并監測心電圖；于胸骨左旁第3、4肋間開胸，剪開心包膜，暴露心臟，左心耳下緣2 mm處進針，肺動脈圓錐旁出針，進針深度1 mm，將6-0縫線與充氣球囊一同結扎左冠脈前降支，關胸；球囊充氣后，心電圖ST段呈明顯弓背抬高作為缺血成功的標志，持續45 min；抽空球囊，再灌注6 h，心電圖抬高的ST段下降50%以上作為再灌注成功的標志。假手術大鼠開胸后只冠脈穿線但不結扎，其余操作同上。

1.6 NBT染色法測定心肌梗死面積 再灌注結束后，每組隨機取6只大鼠，處死后剪取心臟，洗凈，去除心房及右室，置于-20 ℃冷凍30 min，沿長軸切成厚度2 mm的5片，浸于0.1% NBT溶液中，37 ℃下孵育30 min， 10%甲醛溶液固定24 h，正常心肌呈藍色，缺血未梗死心肌呈淺紅色，梗死心肌呈灰白色。顯微鏡下成像，導入圖像分析系統，測算梗死區面積(infarct area, IA)、危險區面積(area at risk, AAR)和心室總面積(left ventricle area, LVA)，計算IA/AAR、IA/LVA以評估心肌梗死情況。

1.7 流式細胞術測定細胞凋亡率 每組取剩余6只大鼠，處死后剪取心臟，洗凈，于冠脈結扎線下方取部分心肌組織，剪碎后加PBS緩沖液充分研磨，收集細胞懸液，1000 r/min低溫離心5 min，棄上清，用PBS緩沖液洗滌數次并重懸，獲得較純的心肌細胞，于光鏡下進行細胞計數，調整心肌細胞濃度約為1×10個/ml；將心肌細胞重懸于70%預冷的乙醇中低溫固定過夜，檢測前1000 r/min低溫離心，用PBS緩沖液洗去乙醇，細胞沉淀用PI低溫避光染色30 min，上流式細胞儀檢測。

1.8 熒光法測定心肌細胞caspase活性 取上述濃度1×10個/ml的心肌細胞，重懸于預冷的裂解緩沖液中，冰浴5 min，10 000 r/min低溫離心5 min，收集上清(胞漿抽提物)，植于96孔板，按試劑盒說明書加入反應試劑和熒光底物，陰性對照孔中加入caspase抑制劑，37 ℃下避光孵育1 h，上熒光酶標儀(激發光波長400 nm，發射光波長505 nm)檢測，以熒光強度(fluorescence units, FU)表示caspase-3、caspase-8活性。

1.9 RT-qPCR法測定心肌組織Fas、Fas-L基因表達 每組于冠脈結扎線下方取部分心肌組織，凍存于-80 ℃液氮中；檢測前精密稱重，研磨成粉，經Trizol試劑法提取總RNA，后反轉錄為cDNA，繼而行RT-qPCR擴增(引物片段長度149～163 bp)，獲取樣本基因Ct值后，以β-actin為內參照進行均一化處理，采用公式2計算樣本基因的相對表達量。

2 結 果

2.1 對心肌梗死面積的影響 假手術組大鼠的梗死區面積為0。與模型組比較，GK高、低劑量組可使IA/AAR和IA/LVA顯著縮小，差異均有統計學意義(<0.05，表1)。

2.2 對心肌細胞凋亡率的影響 假手術組心肌細胞凋亡率為(0.92±0.80)%，模型組細胞凋亡率顯著增高為(43.13±7.05)%。與模型組比較，GK高、低劑量組可使細胞凋亡率明顯降低為(30.12±7.28)%、(31.06±6.39)%，差異均有統計學意義(<0.01，圖1)。

2.3 對心肌細胞caspase活性的影響 與假手術組比較，模型組心肌細胞caspase-3和caspase-8活性均顯著增高，差異有統計學意義(<0.01)。GK高、低劑量組可使caspase-3和caspase-8活性明顯降低，與模型組比較差異均有統計學意義(<0.05，表2)。

2.4 對心肌細胞凋亡相關基因mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組心肌Fas和Fas-L基因表達均顯著增高，組間差異均有統計學意義(< 0.01)。GK高、低劑量組可使Fas和Fas-L基因表達明顯降低，與模型組比較差異均有統計學意義(< 0.05，表3)。

3 討 論

缺血預適應和缺血后適應是MIRI公認有效的治療手段，但具有可控性和依從性較差等缺陷；有學者認為，某些藥物對MIRI的保護作用與缺血預適應和缺血后適應的機制類似，通過激活機體自身保護機制或促使釋放內源性活性物質，進而增強損傷心肌組織對缺血、缺氧的耐受，且藥物干預具備時間可控和操作可控的優點。本研究采用GK預處理方式探討其心肌保護作用，結果表明GK高、低劑量(200、100 mg/kg)均能明顯縮小MIRI動物的心肌梗死面積IA/AAR和IA/LVA，提示GK可能是MIRI防治領域的候選藥物之一。

MIRI所涉及的病理生理機制極為復雜，包括氧化應激、炎癥反應、能量代謝障礙、鈣超載等。近年來“細胞凋亡學說”受到重視，有學者認為，心肌細胞凋亡異常也是MIRI過程中一種重要的病理機制。生理條件下，細胞凋亡有助于維持細胞增殖和細胞死亡間的平衡；MIRI發生時，冠脈再灌注不僅給缺血心肌組織提供賴以生存的氧氣和葡萄糖，同時也為細胞凋亡提供了能量，此時凋亡可誘導過度的細胞死亡，導致不可逆的心肌損害，降低心功能。如何有效減輕再灌注后的細胞凋亡，保護受損的心肌，是MIRI的一個治療方向。據報道，臨床為心肌梗死患者行再灌注治療時，再灌注時間越晚，心肌細胞凋亡現象越明顯；動物實驗研究亦表明，MIRI大鼠心肌組織凋亡細胞顯著增多，缺血再通區域以凋亡細胞為主；大鼠冠脈缺血6 h后的心肌細胞凋亡指數最高，凋亡關鍵蛋白caspase-3、caspase-8活性在缺血3 h開始升高，6 h達高峰。本研究發現，冠脈結扎45 min再灌注6 h后，MIRI大鼠心肌細胞凋亡率與假手術大鼠比較顯著增高，證實細胞凋亡是MIRI過程的重要參與者；GK高、低劑量組明顯降低大鼠心肌細胞凋亡率，提示GK預處理通過抑制凋亡反應，可減輕MIRI過程中心肌損傷，改善心功能。

由細胞表面死亡受體Fas介導、半胱氨酸蛋白酶caspase-8直接參與的死亡受體信號途徑是重要的外源性凋亡通路。當受到缺血、再灌注等外因誘導時，存在于心肌細胞表面的Fas與其死亡配體Fas-L結合，繼而與胞內Fas相關死亡結構結合，募集caspase-8形成死亡誘導信號復合體，并將細胞外的促凋亡信號傳入胞內，啟動caspases級聯反應，最終激活凋亡執行因子caspase-3而引發心肌細胞凋亡。既往研究亦已證實Fas、Fas-L、caspase-8及caspase-3在MIRI進程中發揮重要作用。本研究發現，模型組大鼠心肌組織Fas、Fas-L基因表達及caspase-3、caspase-8活性較假手術組明顯上調，提示冠脈缺血45 min再灌注6 h后，死亡受體信號途徑被激活并參與了MIRI的病理進程；GK高、低劑量組可明顯抑制Fas、Fas-L基因表達及caspase-3、caspase-8活性，說明GK預處理通過抑制死亡受體信號途徑的活化，減輕MIRI過程中的心肌細胞凋亡反應。

總之，GK預處理對MIRI的心肌保護作用與影響Fas介導的死亡受體信號途徑、抑制心肌細胞凋亡反應等有關。鑒于凋亡通路的復雜性和多樣性，其具體作用環節尚有待于進一步研究。