三陰性乳腺癌中AR與Ki-67、CK5/6的表達及相關性分析

王會華 常慶龍△ 崔萍萍 原陽

鄭州大學第三附屬醫院 1)乳腺三科 2)科研中心 鄭州 450012

乳腺癌(breast cancer，BC)是女性中發病率位居第一的惡性腫瘤，隨著分子醫學的發展，BC的分子分型也更加詳細，針對不同靶點的治療方案也逐漸發展。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)是乳腺癌中的一種特殊分子分型，其免疫組化特征是雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)均不表達。TNBC呈高度異質性，生物學行為侵襲性強，易早期復發，有較高遠處轉移、內臟轉移及腦轉移率，進展快，預后差。TNBC缺乏已知治療靶點的受體表達，難以對這類患者進行相應的個體化治療，這就造就了目前TNBC治療方案缺乏的困境，故探討TNBC的臨床病理特征及其各生物標志物間的關系以發現有效的治療靶點，已經成為近年臨床研究的焦點。雄激素受體(androgen receptor, AR)在乳腺癌中廣泛表達，目前認為其在乳腺癌變及癌細胞的遷移及侵襲過程中有重要作用，雖然具體作用機制仍需進一步研究，但TNBC中AR的陽性表達使AR有望成為TNBC的潛在治療靶點[1]。細胞增殖指數(Ki-67)是一種腫瘤標志物，反映乳腺癌中癌細胞的增殖狀態，常用于預測乳腺癌患者的預后。細胞角蛋白5/6(cytokeratins5/6，CK5/6)因在基底層細胞特異性表達的特點一般被用于診斷TNBC中的基底細胞樣類型乳腺癌。有研究認為，AR通過調節PI3K的亞基激活TNBC細胞的遷移與侵襲[2]，而CK5/6與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)共表達，可以激活包括PI3K/AKT/mTOR等在內的一些下游信號通路[3-4]。本研究旨在探討AR、Ki-67、CK5/6與臨床病理特征的關系及其三者的相關性，以望能為TNBC的風險分級和基于分子格局的潛在治療方案提供一些支持。

1 資料與方法

1.1研究對象回顧性分析2016-01—2020-12在我院經病理確診且已行手術治療的115例乳腺癌患者的臨床資料，均為女性；年齡為 29～68歲，中位年齡49歲。腫瘤最大直徑≤2 cm 29例，2～5 cm 86例。無淋巴結受累84例，淋巴結受累31例。組織學分級I～Ⅱ級48例，Ⅲ級67例。納入標準：(1)均參照2015年的St-Gallen共識標準[2]判定為TNBC(ER、PR、HER-2均為陰性)。(2)術前均未進行放療、化療、靶向及內分泌等新輔助治療。臨床資料完整。排除標準：(1)合并高血壓、糖尿病等基礎疾病的患者。(2)初診時有遠處轉移的患者。所有患者的病理切片在顯微鏡下重新由兩位經驗豐富的病理醫師進行雙盲獨立閱片并得出明確診斷。

1.2免疫組化檢測手術切除的腫瘤組織標本用10%的中性緩沖福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片。運用免疫組化SP法進行檢測，以已知陽性切片為陽性對照，并以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。AR、ER、PR、HER-2、Ki-67、CK5/6檢測試劑均自上海羅氏公司購入，試劑盒為即用型試劑盒。

1.3病理結果判讀(1) ER、PR判定標準：腫瘤陽性細胞數<1%則判定為陰性[5]。(2)HER-2判定標準：無著色或≤10的腫瘤細胞膜呈現微弱的、不完整著色為(-)，>10%的腫瘤細胞呈現微弱的、不完整著色為(+)，呈弱-中等的完整細胞膜著色的腫瘤細胞>10%或者呈強而完整的細胞膜著色的腫瘤細胞≤10%為(++)，呈強、完整且均勻的細胞膜著色的腫瘤細胞>10%為(+++)。HER-2表達(-)和(+)判定為陰性。(++)者行原位雜交熒光FISH檢測以進一步明確是否存在擴增，無擴增判定為陰性，有擴增則判定為陽性。(+++)者判定為陽性。(3)AR判定標準：陽性細胞數<10%為(-)，≥10%為(+)。 (4)Ki-67判定標準：細胞核染色呈黃色或棕黃色顆粒的腫瘤細胞即陽性細胞，本研究選擇以40%作為Ki-67分組的界值，陽性細胞率<40%為低表達組，陽性細胞率≥40%為高表達組[6]。(5) CK5/6判定標準：細胞質中出現黃色或棕黃色顆粒的腫瘤細胞為陽性細胞，陽性細胞率≥1%判為陽性，<1%判為陰性。

1.4統計學分析采用SPSS 26.0軟件進行數據處理。分類變量差異性分析用χ2檢驗及Fisher確切概率法，AR與Ki-67及CK5/6的相關性選用Spearman 相關性分析。以α=0.05作為檢驗水平。

2 結果

115例腫瘤標本中，AR表達陽性40例(34.8%)，表達陰性75例(65.2%)。Ki-67高表達98例(85.2%)，低表達17例(14.8%)。CK5/6陽性表達80例(69.6%)，陰性表達35例(30.4%)。見表1。組織學分級在Ki-67分組間的差異存在統計學意義(P<0.05)，組織學分級I～Ⅱ級的TNBC患者在Ki-67低表達組中的占比率高于Ki-67高表達組。患者的年齡、腫瘤最大徑、淋巴結轉移在Ki-67分組間表達差異均無統計學意義(P>0.05)。患者的年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移在AR與CK5/6分組間表達差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。AR與Ki-67、CK5/6在TNBC的表達存在負相關關系，差異有統計學意義(r值分別為0.467和0.350，P<0.05)。見表3。

表1 各組計數及占比

表2 AR、Ki-67、CK5/6在TNBC的表達以及與臨床病理特征的關系

表3 AR、Ki-67、CK5/6的關系

3 討論

乳腺癌已成為女性發病率排名第一的癌癥，TNBC是乳腺癌的一個亞型，占10%～15%[7-8]，是不同表型乳腺癌的異質性集合，目前尚無有效的基于分子標志物表達的治療方案，因此發現TNBC的治療靶點一直都是學者們關注的目標。分析TNBC分子標志物的表達特點及其各個分子標志物之間的關系是近年來研究的熱點，有研究發現AR通過調節PI3K的亞基推動TNBC細胞的遷移和侵襲性，CK5/6可以激活PI3K/AKT/mTOR信號通路[2-4]，而Ki-67被普遍認為可以預測乳腺癌患者的預后。本研究探討了TNBC中AR、Ki-67、CK5/6與臨床病理參數之間的關系及其三者之間的相關性，以期為TNBC的進一步危險分級及為潛在治療靶點提供理論支持。

AR廣泛表達于乳腺癌中，不同分型表達率有所不同，同時也是一種預后指標。有研究表明，AR在TNBC中有維持細胞增殖的作用，與AR相似的ER、PR目前已作為ER和PR陽性乳腺癌內分泌治療的靶點。AR被認為是TNBC很有希望的潛在治療靶點，進一步進行探討對改善TNBC的治療效果具有重要的臨床意義[9-12]。本研究中，AR(+)占比為34.8%，和其他研究結果相近[1，13-15]。TNBC患者的臨床病理特征與AR表達之間無統計學意義的相關性，Asano、Payandeh等[16]的研究結果也證實了這一點。其他研究表明，AR的表達情況與組織學分級、腫瘤大小、淋巴結轉移具有相關性[16-18]， AR陽性判定標準尚未統一，可能是研究結果不同的影響因素之一，同時參考文獻中的研究對象并不全是同一種人種，也是需要考慮的影響因素。

Ki-67 是目前最常用的反映腫瘤細胞增殖狀況的生物標志物，存在于細胞周期除G0期外的其他階段，與腫瘤的發生、浸潤、種植和轉移過程相關[19]。TNBC中Ki-67的陽性表達率遠高于其他分子分型。一項包含7 716名TNBC登記患者的薈萃分析研究表明，雖然目前Ki-67的最佳分界點仍不清楚，但以Ki-67的40%為界值可能可以更好區分不同死亡風險的TNBC患者[6]。以Ki-67的40%為分界點將Ki-67分組，本研究中患者的年齡、腫瘤最大徑、淋巴結轉移與Ki-67表達無相關性，組織學分級與Ki-67表達存在相關性，與文獻[20]的研究結果基本一致。

腫瘤組織CKs常被用來明確腫瘤是否為上皮來源，CK5/6常被用來細分TNBC的基底細胞樣亞型，往往與預后不良有關[21-22]。本研究中CK5/6在TNBC中陽性表達占比為69.6%，在其他研究TNBC中CK5/6陽性占比率的范圍之內[23]。患者的年齡、腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移與CK5/6無相關關系，這與金玉、劉中正等[22-23]的研究結果基本一致。

本研究通過Spearman相關性分析發現，AR與Ki-67、CK5/6在TNBC的表達存在顯著的負相關關系，與周晨陽等[11,18，23]的研究結果基本一致。一項由Payandeh等[16]進行的研究認為AR表達狀態與Ki-67表達狀態無顯著相關關系，這可能跟目前AR陽性判定標準及Ki-67在TNBC中的最佳截斷值仍存在一定爭議有關，不同地區人群及不同人種也有可能會影響結果。

本研究的局限性在于納入研究的例數有限，以及患者的確診時間問題未將AR、Ki-67、CK5/6與預后指標進行相關分析。這也是需要進一步研究的問題，我們希望本研究對于TNBC的風險分級以及預后評估有一定幫助，同時也需要更多更深入的研究，有望發現與之有關的潛在治療方案。