新生兒線粒體12S rRNA基因篩查對(duì)預(yù)防藥物性耳聾的價(jià)值

孫東蘭，王少雄，張 晶，彭園園，喬彥霞，胡亞芳，張 靜

線粒體12S核糖體核糖核酸(ribosomal rbonucleic acid，rRNA)基因位于人類線粒體DNA編碼區(qū)，是線粒體核糖體的重要組件，負(fù)責(zé)完成線粒體內(nèi)的翻譯，參與線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)的合成。線粒體12S rRNA基因是藥物性耳聾相關(guān)的突變熱點(diǎn)區(qū)域，攜帶此基因突變的個(gè)體對(duì)氨基糖苷類抗生素(aminoglycosides antibiotic，AmAn)高度敏感，接觸AmAn可導(dǎo)致不可逆的聽力損傷。因此，對(duì)新生兒進(jìn)行線粒體DNA(mtDNA)12S rRNA的A1555G、C1494T藥物敏感突變位點(diǎn)篩查，對(duì)安全用藥具有重要的指導(dǎo)意義。本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)新生兒進(jìn)行上述基因突變位點(diǎn)篩查，依據(jù)結(jié)果給予用藥指導(dǎo)和后代遺傳性耳聾發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，并對(duì)陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行疫苗預(yù)防接種隨訪分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2018-12至2021-10在石家莊市第四醫(yī)院出生的46 376例新生兒為研究對(duì)象，男女比例1.12∶1。全部新生兒均于出生后2～3 d通過(guò)TEOAE和AABR進(jìn)行了聽力篩查，參與藥物性聾基因檢測(cè)者由其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 藥物性聾基因檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(英盛，濟(jì)南)，ABI 7500擴(kuò)增儀(Thermo Fisher，美國(guó))，ND 2000紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher，美國(guó))。

1.2.2 樣本采集和DNA提取 新生兒出生后采集臍帶血滴血片，或在生后2～3 d采取足跟末梢血3～4滴，自然晾干后從血斑提取基因組DNA，取2 μl用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度。

1.2.3 熒光定量PCR PCR反應(yīng)液完全解凍后放置室溫30 min，充分混勻并短暫離心。每個(gè)PCR反應(yīng)管分裝23 μl待測(cè)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)液，加入2 μl待檢DNA后上ABI 7500擴(kuò)增儀擴(kuò)增。擴(kuò)增程序按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 結(jié)果判定 FAM曲線成S形，且Ct值小于35，HEX(VIC)曲線無(wú)擴(kuò)增或Ct值大于37，結(jié)果為野生型。HEX(VIC)曲線成S形，且Ct值小于35，F(xiàn)AM曲線無(wú)擴(kuò)增或Ct值大于37，結(jié)果為均質(zhì)突變型。FAM曲線成S形，且Ct值小于35，HEX(VIC)曲線成S形，且Ct值小于35，結(jié)果為異質(zhì)突變型。

1.2.5 隨訪 對(duì)攜帶12S rRNA A1555G或C1494T突變的個(gè)體(年齡：5～32月齡)進(jìn)行電話隨訪，主要內(nèi)容包括家族史，藥物應(yīng)用史，孩子是否常規(guī)預(yù)防接種疫苗，聽力情況，言語(yǔ)發(fā)育等。并對(duì)同期生育的嬰幼兒(攜帶者2倍)進(jìn)行是否常規(guī)預(yù)防接種疫苗的隨訪。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用檢驗(yàn)的方法比較攜帶突變嬰幼兒組與未攜帶組疫苗接種率的情況，以<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 新生兒聽力篩查結(jié)果 46 376例新生兒均通過(guò)了TEOAE和AABR的聽力篩查，未檢出聽力異常新生兒。

2.2 藥物性聾基因篩查結(jié)果

2.2.1 基因突變數(shù)據(jù)分析 線粒體12S rRNA基因檢測(cè)結(jié)果中共發(fā)現(xiàn)突變94例，突變攜帶率為0.20%。其中12S rRNA A1555G均質(zhì)突變76例(80.85%)，40例男嬰，36例女嬰；異質(zhì)突變14例(14.89%)，12例男嬰，2例女嬰。C1494T均質(zhì)突變3例(3.19%)，1例男嬰，2例女嬰；異質(zhì)突變1例(1.06%)男嬰。

2.2.2 突變個(gè)體家系隨訪分析 94例家系成員無(wú)耳聾家族史，無(wú)藥物致聾史，攜帶者母親孕期無(wú)有毒有害物質(zhì)接觸史。經(jīng)隨訪72例A1555G 均質(zhì)突變(其他4例拒絕)新生兒的母親知情同意后接受了該項(xiàng)檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，72例均遺傳于母親。11例12S rRNA A1555G異質(zhì)突變(其他3例拒絕)，1例C1494T異質(zhì)突變新生兒的母親知情同意后接受了該項(xiàng)檢測(cè)，其中10例A1555G異質(zhì)突變和1例C1494T異質(zhì)突變遺傳于母親。1例男嬰12S rRNA A1555G 異質(zhì)突變?yōu)樾掳l(fā)，其母親12S rRNA A1555G為野生型，經(jīng)耳聾基因芯片及測(cè)序均證實(shí)。

2.3 疫苗接種病例對(duì)照隨訪分析 攜帶突變嬰幼兒隨訪到88例，失訪6例，隨訪年齡5～32月齡，88例嬰幼兒家長(zhǎng)均知曉禁用氨基糖苷類抗生素，78例按月齡常規(guī)預(yù)防接種疫苗，10例接種部分疫苗(2例幼兒家長(zhǎng)擔(dān)心致聾未接種，8例幼兒判定為接種禁忌證)，正常接種率88.64%。隨訪同期生育的未攜帶突變的嬰幼兒160例，160例嬰幼兒基本按常規(guī)接種時(shí)間接種疫苗(部分嬰幼兒因感冒發(fā)燒的推遲接種)。攜帶突變個(gè)體正常疫苗接種率與未攜帶者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(=16.123，<0.01)。所有隨訪到的嬰幼兒聽力未見異常，言語(yǔ)發(fā)育在同齡水平。

3 討 論

3.1 常規(guī)篩查的意義 常規(guī)的新生兒聽力篩查可以檢出部分聽力障礙患兒，但尚有部分遲發(fā)型聾患者可以通過(guò)聽力篩查，當(dāng)遇到某些誘發(fā)因素時(shí)導(dǎo)致聽力受損，比如藥物性聾患者，出生時(shí)大部分聽力無(wú)異常，只是在生長(zhǎng)過(guò)程中由于使用氨基糖苷類抗生素導(dǎo)致聽力障礙。因此，為了更加完善聽力篩查工作，早發(fā)現(xiàn)，早預(yù)防，除了進(jìn)行常規(guī)物理篩查外，聯(lián)合耳聾基因篩查十分必要。研究顯示聯(lián)合篩查可降低聽力障礙漏診率，尤其是提高藥物性、遲發(fā)型聾的檢出率。

mtDNA是人體細(xì)胞內(nèi)唯一的核外遺傳物質(zhì)，是細(xì)胞能量代謝的來(lái)源，亦是氧化磷酸化的中心，對(duì)保持細(xì)胞正常功能起重要作用。在遺傳性非綜合征性聾中，線粒體遺傳約占2%，其中12S rRNA上的C1494T和A1555G和藥物性聾密切相關(guān)。Prezant等在1例阿拉伯-以色列非綜合征型聾家系中研究指出：1555位于高度保守的小rRNA結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域被2個(gè)保守的莖環(huán)切割，當(dāng)發(fā)生A1555G突變時(shí)會(huì)破壞小rRNA結(jié)構(gòu)，影響線粒體核糖體的翻譯能力，ATP產(chǎn)量下降，細(xì)胞內(nèi)外離子濃度失衡，最終導(dǎo)致線粒體功能障礙。在耳蝸的外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞和血管紋中含有大量的線粒體。在耳蝸底轉(zhuǎn)的外毛細(xì)胞含量更多，所以線粒體的功能異常更易影響高頻聽力。

線粒體DNA 12S rRNA A1555G和C1494T位點(diǎn)(分別對(duì)應(yīng)E.coli 16S rRNA的1491位點(diǎn)和1409位點(diǎn))位置相對(duì)但并不配對(duì)。當(dāng)發(fā)生A1555G突變或C1494T 突變時(shí)， 線粒體核糖體A位形成了一個(gè)新的1494-1555G-C或 A-U堿基配對(duì)， 使得線粒體12S rRNA基因與E.coli 16S rRNA相應(yīng)解碼區(qū)更加相似， 增強(qiáng)了氨基糖苷類藥物在12S rRNA A位的結(jié)合力。因此，使用氨基糖苷類藥物會(huì)導(dǎo)致或加重?cái)y帶A1555G 或 C1494T突變個(gè)體的聽力喪失。美國(guó)的研究顯示12S rRNA基因 A1555G 突變可以增加耳蝸對(duì)氨基糖苷類藥物的敏感性。西班牙的非綜合征型家系調(diào)查研究顯示A1555G 突變與15%～20%的家族性非綜合征型聽力損失有關(guān)，許多年老的家族成員即使沒(méi)有使用氨基糖苷類藥物也可發(fā)生聽力下降。在中國(guó)群體的研究發(fā)現(xiàn)12S rRNA A1555G和C1494T 突變與藥物性聾有關(guān)。

藥物性聾患者基本都能通過(guò)聽力篩查，如果個(gè)體攜帶與細(xì)菌的核糖體更加相似的1555G 或 1494T突變，則對(duì)氨基糖苷類藥物超敏感，當(dāng)使用氨基糖苷類藥物時(shí)導(dǎo)致聾。而且線粒體DNA 12S rRNA突變?yōu)槟赶颠z傳，女性的子代均為突變基因攜帶者，男性個(gè)體為攜帶者但不會(huì)遺傳給下一代。本研究對(duì)46376例在本院分娩的新生兒進(jìn)行藥物性聾基因篩查發(fā)現(xiàn)A1555G和C1494T突變率為0.20%，雖然低于山西長(zhǎng)治(0.35%)，北京市(0.27%)，浙江省長(zhǎng)興縣(0.28%)，廣東東莞地區(qū)(0.22%)等地的藥物致聾基因突變率，但高于邯鄲(0.15%)，紹興(0.12%)及廣東省江陽(yáng)市(0.11%)等地區(qū)。鄭錦等發(fā)現(xiàn)，河南洛陽(yáng)地區(qū)線粒體DNA 12S rRNA基因變異的陽(yáng)性攜帶率為0.23%，最常見變異類型為A1555G異質(zhì)性變異；本研究結(jié)果顯示最常見的變異是A1555G 均質(zhì)突變，占80.85%，這也提示突變率和變異類型均可能存在地域差異性。

本研究還發(fā)現(xiàn)10例12S rRNA A1555G異質(zhì)突變(其他3例拒絕)，1例C1494T異質(zhì)突變均遺傳于母親。發(fā)現(xiàn)1例新發(fā)12S rRNA A1555G異質(zhì)突變，其母親在孕期聾基因篩查顯示12S rRNA A1555G為野生型，胎兒出生后做藥物性聾基因檢測(cè)為12S rRNA A1555G異質(zhì)突變，并通過(guò)聾基因芯片及Sanger測(cè)序檢測(cè)驗(yàn)證。首先，目前關(guān)于導(dǎo)致12S rRNA A1555G突變的分子機(jī)制尚不明確，因此尚需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、線粒體的功能實(shí)驗(yàn)等研究進(jìn)一步探索引起12S rRNA A1555G新發(fā)突變的影響因素及相關(guān)機(jī)制；其次，目前關(guān)于12S rRNA A1555G新發(fā)突變的發(fā)生率尚無(wú)確切數(shù)據(jù)，尚需通過(guò)臨床研究進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；再次，12S rRNA A1555G突變?cè)诖鷤鬟f時(shí)是否存在異質(zhì)率增加的情況，比如本例胎兒的母親可能也存在12S rRNA A1555G異質(zhì)突變，但異質(zhì)率尚未達(dá)到現(xiàn)有檢測(cè)的下限。最后，是否存在生殖腺嵌合？我們將帶著這些疑問(wèn)開展后期的研究探索。

3.2 隨訪攜帶突變的陽(yáng)性個(gè)體的疫苗接種情況 本研究還對(duì)88例陽(yáng)性個(gè)體(6例失訪)進(jìn)行電話隨訪，隨訪年齡為5～32月齡。88例嬰幼兒家長(zhǎng)均已接受用藥指導(dǎo)，78例(88.64%)嬰幼兒已常規(guī)預(yù)防接種疫苗，10例(11.36%)只接種了部分疫苗。隨訪同期生育的未攜帶突變的嬰幼兒160例，均接種疫苗。文獻(xiàn)[20]報(bào)道攜帶A1555G等突變的具有遺傳易感性的患者即使用常規(guī)劑量或極小劑量的AmAn即可發(fā)生耳毒性反應(yīng)，可能造成極重度且不可逆轉(zhuǎn)聾；對(duì)于兒童而言， 即使輕度聽力損失也會(huì)對(duì)其言語(yǔ)發(fā)育及心理社會(huì)發(fā)育產(chǎn)生不良影響。給藥途徑及局部給藥部位對(duì)AmAn耳毒性作用亦有影響，椎管內(nèi)給藥最危險(xiǎn)，其次為靜脈和肌內(nèi)注射。鄧水秋等發(fā)現(xiàn)，對(duì)于適齡的線粒體A1555G基因突變攜帶女童，最好禁止使用含氨基糖苷類抗生素的疫苗。部分父母擔(dān)心孩子注射含有氨基糖苷類抗生素的疫苗會(huì)影響孩子聽力，在尚無(wú)公開的的指導(dǎo)意見或?qū)＜夜沧R(shí)的前提下，選擇放棄接種疫苗。文獻(xiàn)[23]對(duì)以往研究進(jìn)行綜述，尚不能推斷疫苗中痕量的抗生素會(huì)導(dǎo)致聾。AEFIIMS數(shù)據(jù)亦未呈現(xiàn)出線粒體12S rRNA位點(diǎn)突變兒童接種疫苗后引起兒童聾的報(bào)道。腎臟是氨基糖苷類抗生素排泄的唯一途徑，對(duì)于腎臟功能正常的人群，耳毒性抗生素以正常的排泄速率被排出到體外。疫苗中氨基糖苷類抗生素的最大殘留量很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于臨床常規(guī)劑量，在嬰幼兒腎功能正常的前提下，接種疫苗應(yīng)該是相對(duì)安全的。本研究隨訪結(jié)果也提示，接種疫苗是相對(duì)安全的，若能開展痕量AmAn耳毒性的研究，明確其耳毒性閾值，將有利于指導(dǎo)疫苗中抗生素的殘留量，進(jìn)一步提高接種疫苗的安全性。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)線粒體聾基因篩查，可從分子水平發(fā)現(xiàn)有可能發(fā)生聽力損傷的新生兒，對(duì)藥物性聾高危患兒的終生用藥提供指導(dǎo)，避免遲發(fā)聾的發(fā)生，具有重要的社會(huì)效益，同時(shí)也進(jìn)一步證實(shí)了該疫苗的安全性，為相關(guān)指南的出臺(tái)提供臨床依據(jù)。