基于G1-熵權法的正交試驗優選蔞芍痙攣平顆粒水提工藝*

嚴國鴻，許 文，徐 偉

（1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004；2.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建 福州 350122）

蔞芍痙攣平方［1］包括瓜蔞、白芍、桂枝、川芎、地龍、華重樓、甘草7味藥材，干預腦卒中后癱瘓肢體肌肉痙攣療效確切。由于湯劑的服用量大、攜帶不便、易發霉變質、口感差等缺點［2］，其應用受到限制。根據福建省《醫療機構制劑注冊管理辦法》及原國家食品藥品監督管理總局《關于對醫療機構應用傳統工藝配制中藥制劑實施備案管理的公告》（2018年第19號）等要求，擬將蔞芍痙攣平方開發成院內制劑蔞芍痙攣平顆粒，以擴大臨床使用范圍。中藥復方具有“多成分，多靶點”的治療特性，評價提取工藝優劣時僅憑單一或少數成分具有局限性，故需進行多成分考察。近年來，超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法因其分離速度快、靈敏度高、測定專屬性強等優點，廣泛用于中藥及復方制劑復雜體系的分析中［3-6］。為應對目前中藥復方提取工藝的瓶頸，本研究中基于質量源于設計（QbD）理念，采用UPLC-MS/MS法同時測定萎芍痙攣平顆粒多成分含量，并結合G1-熵權法，通過正交試驗優化提取工藝，為后續中藥復方的開發利用奠定基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Xevo TQ-S型超高效液相色譜串聯三重四極桿質譜儀（美國Waters公司）；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；HDM-2000型調溫恒溫電熱套（常州國華電器有限公司）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號為110736-201842，含量97.4%），甘草苷對照品（批號為111610-201908，含量95.0%），木犀草苷對照品（批號為111720-201810，含量98.2%），肉桂酸對照品（批號為110786-201503，含量97.9%），阿魏酸對照品（批號為110773-201915，含量99.4%），甘草酸對照品（批號為110731-202021，含量97.7%），重樓皂苷Ⅶ對照品（批號為100081-201610，含量98.1%），重樓皂苷Ⅱ對照品（批號為111591-201604，含量98.4%），重樓皂苷Ⅰ對照品（批號為111590-201604，含量98.3%），均購于中國食品藥品檢定研究院。甲酸為色譜純，甲醇、乙腈為質譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。瓜蔞根藥材飲片（批號為180701）、白芍藥材飲片（批號為201101）、地龍藥材飲片（批號為200801），均購于北京本草方源（亳州）藥業科技有限公司；桂枝藥材飲片（亳州市慈濟堂中藥飲片有限公司，批號為2010012）；川芎藥材飲片（安國市一方藥業有限公司，批號為20090303）；重樓藥材飲片（湖北金貴中藥飲片有限公司，批號為A201105）；甘草藥材飲片（廈門燕來福制藥有限公司，批號為201126）。飲片均經福建中醫藥大學藥用植物實驗室范世明高級實驗師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 試驗條件

色譜條件：色譜柱為Waters CORTECS C18柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min時87%B；0.5～4.5 min時87%B→80%B；4.5～6.5 min時80%B→68%B；6.5～9.0 min時68%B→10%B）；流速為0.25 mL/min；柱溫為40℃；進樣量為2 μL。

質譜條件：電噴霧正負離子多反應監測模式；毛細管電壓2.5 kV；錐孔電壓3.00 V；脫溶劑氣流為氮氣，流速800 L/h，脫溶劑溫度500℃；錐孔氣流為氮氣，流速50 L/h；離子源溫度150℃；提取因子（Extractor）3.00 V；碰撞氣體為氬氣。各成分質譜檢測其他參數見表1（其中ES+為正離子模式，ES-為負離子模式）。

表1 各成分質譜檢測參數Tab.1 Mass spectrometry parameters of each component

2.1.2 溶液制備

取芍藥苷、甘草苷、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、甘草酸、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ對照品各適量，精密稱定，加20%甲醇溶解制成上述成分質量濃度分別為1.038，0.782，1.072，0.741，0.944，1.128，0.992，1.052，1.058 mg/mL的單一對照品貯備液。精密量取各適量，加20%甲醇稀釋得上述成分質量濃度分別為103.80，15.64，5.36，7.41，4.72，56.40，4.96，5.26，5.29 μg/mL的混合對照品溶液。按后續提取工藝提取蔞芍痙攣平顆粒，將所得提取液（含1個處方量75 g藥材飲片：瓜蔞、白芍藥材飲片各18 g，桂枝、川芎、地龍藥材飲片各9 g，重樓、甘草藥材飲片各6 g）濃縮，加水定容至100 mL，精密吸取0.1 mL，置50 mL容量瓶中，加20%甲醇定容，經0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。以20%甲醇作為空白對照溶液。

2.1.3 方法學考察

系統適用性試驗：取2.1.2項下除單一對照品貯備液外的3種溶液各適量，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結果供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液相應位置有相應吸收峰。詳見圖1。

圖1 超高效液相色譜串聯質譜圖1.Paeoniflorin 2.Liquiritin 3.Cynaroside 4.Cinnamic acid 5.Ferulic acid 6.Glycyrrhizic acid 7.PolyphyllinⅦ8.PolyphyllinⅡ9.PolyphyllinⅠA.Blank reference solution B.Mixed reference solution C.Test solutionFig.1 UPLC-MS/MS chromatograms

線性關系考察：精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液20，50，100，200，400，1 000 μL，分別置10 mL容量瓶中，加20%甲醇定容，搖勻，分別取適量，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程和線性范圍見表2。

檢測限和定量限考察：取9種待測成分的單一對照品貯備液各適量，逐一稀釋，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，以信噪比（S/N）為3和10時待測成分的質量濃度分別記作檢測限和定量限。結果見表2。

表2 線性關系及檢測限、定量限考察結果Tab.2 Results of linear relation test，limit of detection and limit of quantitation

精密度試驗：取混合對照品溶液適量，按2.1.1項下試驗條件，1 d內連續進樣測定6次，以及連續3 d、每天進樣測定3次，記錄峰面積。結果芍藥苷、甘草苷、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、甘草酸、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ日內精密度的RSD分別為3.21%，

2.31%，3.42%，2.49%，2.02%，2.22%，1.59%，1.12%，3.23%（n=6）；日間精密度的RSD分別為2.57%，1.39%，2.72%，3.11%，1.52%，2.51%，2.61%，3.27%，1.51%（n=3），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液適量，室溫下分別于0，2，4，8，12，24 h時按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積。結果芍藥苷、甘草苷、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、甘草酸、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ峰面積的RSD分別為3.51%，2.89%，2.22%，3.23%，2.44%，2.12%，3.48%，2.11%，1.79%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：精密吸取同一樣品提取液0.1 mL，共6份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果芍藥苷、甘草苷、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、甘草酸、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ的平均含量分別為每0.1 mL含393.86，31.74，18.94，15.88，10.18，36.86，14.92，7.88，8.96 μg，RSD分 別 為3.48%，3.02%，3.63%，3.82%，4.19%，2.71%，2.34%，3.29%，3.21%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的樣品提取液0.05 mL，分別加入各成分對照品適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下試驗條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.2 得膏率測定

1個蔞芍痙攣平顆粒處方量的藥材飲片經后續最佳提取工藝提取后，離心，濾過，精密吸取25 mL，60℃減壓濃縮得浸膏，真空干燥48 h得干浸膏，計算得膏率。得膏率=（m干×V）/（25×m總）×100%，其中m干為干燥膏質量（g），V為提取液體積（mL），m總為復方提取飲片總質量（g）。

2.3 提取工藝研究

2.3.1 單因素考察

浸泡時間：稱取1組蔞芍痙攣平顆粒藥材飲片（每組2份，每份75 g），加10倍量水（約750 mL）浸泡，分別于0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 h時取出，稱定質量，計算吸水率。結果見表4。可見，浸泡3 h后吸水率幾乎達到峰值，且隨浸泡時間延長吸水率趨于平緩，故浸泡時間確定為3 h。

表4 浸泡時間考察結果（n=2）Tab.4 Results of the investigation of soaking time（n=2）

提取時間：取蔞芍痙攣平顆粒藥材飲片適量（每組平行2次），共5組，加8倍量水，浸泡3 h，分別加熱回流1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h（保持微沸），提取1次，按2.1項下UPLC-MS/MS法測定9個成分的含量，計算得膏率。結果見表5。

加水量：取蔞芍痙攣平顆粒藥材飲片適量（每組平行2次），共5組，分別加入6，8，10，12，15倍量水，浸泡3 h，加熱回流2 h（保持微沸），提取1次，同法測定9個成分的含量，計算得膏率。結果見表5。

提取次數：取蔞芍痙攣平顆粒中藥飲片適量（每組平行2次），共3組，分別加入8倍量水，浸泡3 h，加熱回流1.5 h（保持微沸），分別提取1，2，3次，同法測定9個成分的含量，計算得膏率。結果見表5。

表5 提取時間、加水量及提取次數考察結果（n=2）Tab.5 Results of the investigation of extraction time，water addition and extraction times（n=2）

2.3.2 綜合評分（Pj）計算

各指標權重賦值采用評價指標G1法主觀賦權和熵權法客觀賦權相結合的組合賦權法。

G1法［7-8］：設同級評價指標為｛x1，x2，…，xm｝，確定各指標順序關系。設rk為wk-1于wk的重要程度之比，且k=m，m-1，…，2，則wk-1=rkw（k=m，m-1，…，2）。計算權重系數wk，公式如下。

熵權法［9-10］：對實驗數據矩陣歸一化，設m個評價指標，n個評價對象的試驗數據矩陣為X=（xij）n×m，對其歸一化后得到屬性矩形R=（rij）n×m，對效益型屬性（指屬性值愈大愈好的指標）而言，進行歸一化，公式如下。

其中xij為第i個評價對象的第j項指標數據，xjmax、xjmin分別為xij的最大值、最小值，i=1，2，…，n；j=1，2，…，m。

求取指標熵值sj，公式如下。

其中fij為正交數據經矩陣排列后第j項指標下第i個樣本值占該指標的比重，當fij=0時，xijlnn=0。并計算各指標權重系數wj，公式如下。

G1-熵權法的組合權重確定［11］：設定由G1法得到的主觀權重為w1，熵權法得到的客觀權重為w2，組合權重wj計算公式如下。

依據復方“君臣佐使”配伍原則及功效相關藥效物質，由G1法確定7個評價指標的重要性依次為得膏率（源于全方）>木犀草苷（源于瓜蔞）>芍藥苷（源于白芍）=肉桂酸（源于桂枝）>重樓皂苷（Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ源于華重樓）>阿魏酸（源于川芎）>甘草苷+甘草酸（源于甘草），權重評價標度分別為r2（得膏率及木犀草苷）=1.5、r3（木犀草苷及芍藥苷）=1.2、r4（芍藥苷及肉桂酸）=1.0、r5（肉桂酸及重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ）=1.2，r6（重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ及阿魏酸）=1.2、r7（阿魏酸及甘草苷、甘草酸）=1.2，求得7個指標主觀權重值w1，再用熵權法計算各指標客觀權重值w2，然后計算組合權重值w和綜合評分Pj，計算公式如下，權重值見表6。

表6 提取工藝評價指標權重值Tab.6 Weight value of evaluation indexes of the extraction process

2.3.3 正交試驗設計與結果

根據單因素試驗考察結果，以加水量（X）、提取時間（Y）、提取次數（Z）為考察因素，以芍藥苷、甘草苷+甘草酸、木犀草苷、肉桂酸、阿魏酸、重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ的含量及得膏率的綜合評分Pj為評價指標，進行L9（34）正交試驗設計。因素和水平見表7，試驗設計和結果見表8，方差分析結果見表9。由表8及表9可知，因素X，Y，Z對蔞芍痙攣平顆粒水提工藝均有顯著影響（P<0.05），且影響強度為Z>X>Y。因此，確定最佳工藝為X3Y3Z2，即每次水提時，加10倍量水，浸泡3 h，提取2次，每次2.0 h。

表7 因素與水平Tab.7 Factors and their levels

表8 L9（34）正交試驗設計與結果Tab.8 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表9 方差分析結果Tab.9 Results of the ANOVA

2.2.4 驗證試驗

分別稱取3份處方量藥材飲片，共225 g，按最佳工藝條件進行水提，并計算得膏率，結果見表10。可見，9個成分含量的RSD值均小于2.50%（n=3），表明該方法穩定、可行。

表10 驗證試驗結果（n=3）Tab.10 Results of the verification test（n=3）

3 討論

3.1 評價指標選擇

蔞芍痙攣平方是福建中醫藥大學附屬人民醫院梁暉主任臨床經驗方，由經典方栝樓（瓜萎）桂枝湯加減而成，方中君藥瓜蔞，味甘、微苦，性寒，入肺胃二經，清熱瀉火、潤燥柔筋，用于此方，既能清熱降火以消熱之源，又能生津柔筋以緩脈急，益陰分津液，養其筋經，標本兼顧。輔以桂枝、芍藥為臣藥，桂枝味辛、甘，性溫，入血分，溫經通脈活絡；芍藥味酸、甘，性寒，養陰舒筋，益君藥養陰柔肝，舒筋止痛。佐以華重樓，其味苦，性微寒，歸肝經，清熱解毒，涼肝定驚；川芎味辛，性溫，入肝、膽心包經，活血行氣，祛風止痛；地龍味咸，性寒，歸肝、脾經，清熱涼血、通絡止痛，擅治高熱神昏、驚癇抽搐、關節痹痛、肢體麻木、半身不遂；以炙甘草為使藥，調和諸藥，益氣和中。全方具有清熱養陰、柔筋緩急、活血通絡之效。以2020年版《中國藥典（一部）》與現代藥理學研究為指導，瓜蔞在藥典中雖無指標性成分，但研究表明，其中木犀草苷成分能抑制腦組織核因子κB激活信號，從而發揮重要的神經保護作用，為腦缺血治療提供有效方法［12］。白芍中芍藥苷可作為一種新型的抗血小板藥物，通過調節血管性血友病因子與血小板糖蛋白Ib（GP Ib）的相互作用，抑制剪切應力誘導的血小板聚集和擴張血管，促進血液流通［13］，又能抑制神經炎性蛋白ASK1磷酸化，從而減輕神經病理性疼痛［14］，對于腦卒中的治療具有重要意義。桂枝的指標性成分肉桂酸，在桂枝中含量較高［15］，且具有通過內皮依賴的方式松弛血管，誘導血管舒張，達到促進血流通暢的作用［13］。川芎中阿魏酸能抑制Toll樣受體/髓樣分化因子88信號通路，并對氧供應不足和血流恢復不足的腦缺血疾病起到保護作用［16］；華重樓中的重樓皂苷（Ⅰ，Ⅱ，Ⅶ）可抑制內皮素的分泌，降低血壓，保護心血管系統［17］。甘草中甘草苷和甘草酸具有很強的抗炎活性，能通過減少巨噬細胞炎性因子的釋放和抑制前列腺素E2合成的花生四烯酸代謝途徑中的關鍵酶［18］，緩解腦卒中引發的神經炎癥。因此，綜合全方的指標性成分，最終選擇用于優化提取工藝的指標成分為木犀草苷、芍藥苷、肉桂酸、重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ、阿魏酸、甘草苷+甘草酸。

3.2 主客觀賦權結合正交試驗設計

為獲得全方活性成分最佳提取工藝參數，先通過單因素試驗，以浸泡時間、加水量、提取時間以及提取次數為考察因素，再通過正交試驗優化提取工藝條件。因該方前期臨床采用湯劑，且患者使用后有確切療效，結合預試驗結果，確定本課題沿用水作為提取溶劑。在該過程中，賦予各指標權重直接關系到結果的科學合理性。本試驗中采用了近些年在中藥提取工藝領域常用的G1-熵權法［19-21］，其中，G1法為主觀賦權法，該方法依據處方中“君臣佐使”配伍規律進行賦權，木犀草苷、芍藥苷、肉桂酸、重樓皂苷Ⅰ+Ⅱ+Ⅶ、阿魏酸及甘草苷+甘草酸的主觀權重系數分別為0.168 9，0.140 7，0.140 7，0.117 3，0.097 7，0.081 4。得膏率可直觀反映水溶性成分的總含量，因此加大其主觀權重系數為0.253 3。熵權法為客觀賦權法，該方法的權重系數由試驗數據綜合評判而來，最后將主觀與客觀權重系數相結合，得到組合權重系數。該方法既可避免只根據專家主觀評判而忽視試驗數據特征，又可避免忽視專家經驗的主觀信息而過于依賴數據，使結果更科學、合理。

綜上所述，蔞芍痙攣平顆粒最佳提取工藝為，藥材飲片加10倍量水浸泡3 h，煎煮2次，每次2 h。該工藝數據可為后期蔞芍痙攣平顆粒申報院內制劑奠定基礎。