甲硝唑凝膠微生物限度檢查方法適用性研究

馮 璐，曹 敏，鈕曉淑，張姝麗，柏大為△

（1.江蘇省泰州市藥品檢驗院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇省泰州市人民醫院，江蘇 泰州 225300）

藥品微生物控制是保障藥品安全性的重要措施［1］，藥品的微生物限度檢查對于控制藥品質量和制劑安全性至關重要。甲硝唑凝膠為局部外用類藥物，適用于炎性丘疹、膿皰瘡或酒糟鼻、紅斑等治療。可根據2020年版《中國藥典（四部）》通則1105-1107項下要求，建立其微生物檢查方法。但進行微生物限度檢查前，需消除樣品本身的抑菌性［2］。本品輔料中所含卡波姆是凝膠劑中應用較廣的一種基質［3］，具有對皮膚親和、易涂抹、不具油膩性、釋藥迅速等特點，被用作局部外用類藥品［4］的輔料，而其黏合度易受酸堿度、金屬離子等影響。薄膜濾過時，由于甲硝唑凝膠中卡波姆的存在，稀釋液中形成膠體溶液，堵塞薄膜，導致供試液不能經0.45 μm濾膜濾過，難以沖洗，從而影響該檢查。為消除這部分影響并選取最適宜的濾過方法，選取硫酸鎂與供試液中的卡波姆絡合，從而形成沉淀以方便過膜。為更好地體現不同方法對具有抑菌性類藥物微生物限度檢查的適用性，本研究中另采用常規平皿法和中和劑法進行探討。現報道如下。

1 儀器、試藥與菌株

儀器：SHP-250型生化培養箱（上海三發科學儀器有限公司，精度為0.1℃）；QUINTIX1102-1CN型電子天平（賽多利斯科學儀器<北京>有限公司，精度為0.01 g）；HTY-APL01型集菌儀（浙江泰林生物技術股份有限公司）；1300 SERIES A2型生物安全柜（美國Thermo Fisher公司）。

試藥：甲硝唑凝膠（江蘇知原藥業有限公司，批號為200350，規格為20 g∶0.15 g）；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號為1091715）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號為1085674）、胰酪大豆胨液體培養基（批號為1086275）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為1086835）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號為1091355）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號為2006045），均購自廣東環凱微生物科技有限公司，規格均為每瓶250 g。

菌株：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa［CMCC（B）10104］、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］、白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98001］、黑曲霉Aspergillus niger［CMCC（F）98003］，均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

菌液：按照2020年版《中國藥典（四部）》［5］通則1105及1106要求，取上述試驗菌經培養后制成適宜濃度的菌液。

供試品溶液：稱取樣品10 g，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）的供試品溶液Ⅰ；稱取樣品10 g，加入含3%吐溫80和0.3%卵磷脂［6-7］的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）供試品溶液Ⅱ；取樣品10 g，置裝有6～10顆玻璃珠的錐形瓶內，加入0.9%無菌氯化鈉（含0.5%，1%，3%硫酸鎂）溶液至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）的供試品溶液，靜置沉淀，取上清液，即得供試品溶液Ⅲ。

2.2 需氧菌總數計數方法適用性試驗

2.2.1 常規法（平皿法）及中和劑法

試驗組：取2.1項下供試品溶液Ⅰ或Ⅱ各5份，每份9.9 mL，置試管中，分別加入5種菌的菌液0.1 mL，使供試品溶液含菌量均不大于100 cfu/mL。分別取適量，注入2個平皿，每皿1 mL。分別注入胰酪大豆胨瓊脂培養基及沙氏葡萄糖瓊脂培養基（其中前3種菌株僅以前一培養基培養），分別置30～35℃及20～25℃培養箱中培養。

供試品對照組：取2.1項下供試品溶液適量，以稀釋液（0.9%無菌氯化鈉溶液，下同）代替菌液，同試驗組操作。

菌液對照組：取不含中和劑（聚山梨酯80，下同）及滅活劑的相應稀釋液適量代替供試品溶液，按試驗組操作，加入菌液并進行微生物回收試驗。

取上述3組溶液，分別檢測5種菌株含菌量，計算回收比。試驗組的回收比=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數。結果見表1及表2（表中左列數據為使用胰酪大豆胨瓊脂培養基得到，右列數據為使用沙氏葡萄糖瓊脂培養基得到）。

表1 常規法試驗菌回收試驗結果Tab.1 Results of the recovery test of test microorganisms by the conventional method

表2 中和劑法試驗菌回收試驗結果Tab.2 Results of the recovery test of test microorganisms by the neutralization method

2.2.2 薄膜過濾法

試驗組：取2.1項下供試品溶液Ⅲ（含0.5%，1.0%，3.0%硫酸鎂）各5份，每份9.9 mL，置試管中，分別加入5種菌的菌液0.1 mL，使供試品溶液含菌量不大于100 cfu/mL。取適量，經0.45 μm濾膜濾過，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，取出濾膜，貼至胰酪大豆胨瓊脂培養基及沙氏葡萄糖瓊脂培養基，分別置30～35℃及20～25℃培養箱中培養。

稀釋液對照組：取等體積含中和劑或滅活劑的稀釋液代替供試品溶液Ⅲ，同試驗組操作。

供試品對照組與菌液對照組：操作同2.2.1項下相應組的要求。

取上述4組溶液，分別檢測5種菌株含菌量，計算回收比。試驗組回收比的計算公式同2.2.1項，中和劑或滅活劑的回收比=中和劑或滅活劑對照組菌落數/菌液對照組菌落數。

2.2.3 改良薄膜過濾法

常規法中，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收比均為0，不達標。加入中和劑后，金黃色葡萄球菌回收比為0.79，符合規定（0.5～2.0）；枯草芽孢桿菌回收比為0.70，需進一步改進。現在2.2.2項薄膜過濾法基礎上，選擇供試品溶液Ⅲ，沖洗液為pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（100 mL、300 mL、500 mL），稀釋劑對照組對枯草芽孢桿菌進行回收試驗，結果見表3。據此選擇0.9%氯化鈉溶液（含0.5%硫酸鎂），沖洗液為pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（300 mL），進行5種試驗菌的回收試驗，結果見表4。

表3 改良薄膜過濾法枯草芽孢桿菌回收試驗結果Tab.3 Results of the recovery test of Bacillus subtilis by the modified membrane filtration method

表4 改良薄膜過濾法試驗菌回收試驗結果Tab.4 Results of the recovery test of test microorganisms by the modified membrane filtration method

由表1可見，霉菌（黑曲霉）、酵母菌（白色念珠菌）總數采用常規法檢測時回收比符合規定，故無須使用薄膜過濾法。試驗組取加0.9%無菌氯化鈉（含0.5%硫酸鎂）溶液制備的供試品溶液Ⅲ6份，每份9.9 mL，置試管中，分別加入白色念珠菌和黑曲霉的菌液0.1 mL，使供試品溶液含菌量不大于100 cfu/mL，其余各組操作同2.2.1項下常規法相應組要求。取適量，各注入2個平皿，每皿1 mL。注入沙氏葡萄糖瓊脂培養基，20～25℃培養，結果見表5。

表5 平皿法白色念珠菌及黑曲霉回收試驗結果Tab.5 Results of the recovery test of of Candida albicans and Aspergillus niger by the plate-count method

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗

2.3.1 供試品溶液制備

取樣品10 g，加入0.9%無菌氯化鈉溶液（含0.5%硫酸鎂）至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）的供試品溶液，靜置沉淀，取上清液，即得供試品溶液Ⅳ。

2.3.2 金黃色葡萄球菌檢查方法驗證

常規法：取供試品溶液Ⅳ10 mL，置200 mL胰酪大豆胨液體培養基中，加入含菌量不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌菌液于培養溫度下培養規定時間后，取培養物劃線接種至甘露醇氯化鈉瓊脂培養基上，依法檢查。結果前一培養基清澈，后一培養基上無菌落生長。

薄膜過濾法：取供試品溶液Ⅳ10 mL，薄膜濾過，沖洗液為pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（300 mL），薄膜置200 mL胰酪大豆胨液體培養基中，加入含菌量不大于100 cfu的金黃色葡萄球菌菌液，于培養溫度下培養規定時間后按常規法操作。結果前一培養基渾濁，后一培養基上有典型菌落生長。

2.3.3 銅綠假單胞菌檢查方法驗證

采用常規法和薄膜過濾法（操作同2.3.2項，僅甘露醇氯化鈉瓊脂培養基換成溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基）。結果無論采用常規法還是薄膜過濾法，前一培養基均出現渾濁，后一培養基上均有典型菌落生長。

2.4 最佳微生物限度檢查方法

供試品溶液：取樣品10 g，加入0.9%無菌氯化鈉溶液（含0.5%硫酸鎂）至100 mL，充分混勻，制成1∶10（m/V）的供試品溶液Ⅴ，靜置沉淀，取上清液，備用。

需氧菌總數檢測溶液：取1∶10（m/V）供試品溶液1 mL，采用薄膜過濾法，以300 mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，取出濾膜，貼至胰酪大豆胨瓊脂培養基，置30～35℃培養箱中培養。

霉菌和酵母菌總數檢測溶液：取1∶10（m/V）供試品溶液2 mL，注入2個平皿，每皿1 mL。注入沙氏葡萄糖瓊脂培養基，置20～25℃培養箱中培養。

控制菌檢測溶液：取1∶10（m/V）供試品溶液10 mL，采用薄膜過濾法，以300 mL pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，取出濾膜，接種于200 mL胰酪大豆胨液體培養基中，置規定培養溫度下培養。

3 討論

甲硝唑凝膠為凝膠類制劑，具有較強的抑菌活性，故在試驗中需要優先考慮消除藥品自身的抑菌性。本試驗中采取加入中和劑和薄膜過濾的方法，為了更有效對比其中差異，另做常規法進行數據比較。結果顯示，常規法中均有試驗組的回收比低于0.5，不符合藥典的要求，不能建立行之有效的需氧菌總數計數方法，且不同來源、不同濃度的中和劑聚山梨酯80對枯草芽孢桿菌的抑制作用差異較大［8］，導致方法重復性較差，故采用薄膜過濾法。而在進行薄膜過濾法時，由于藥品中存在卡波姆［9］，會堵塞濾膜，導致無法正常過濾。對此，可采用金屬離子絡合形成沉淀的方法解決。

在消除供試品溶液抑菌活性的同時，還可對相應方法進行改進。1）需考慮供試品溶液制備步驟及方法對微生物的損耗程度［10］。加入0.5%硫酸鎂后，可適當增加沉淀時間，取上清液更有效。選用靜置而非離心取上清，是為了避免對微生物造成損傷［11］。但靜置時間也不宜過長，否則可能導致微生物繁殖或死亡［12］。2）因pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液會與金屬離子產生沉淀，影響過膜，故選取0.9%無菌氯化鈉溶液作為稀釋劑制備供試品溶液［13］。3）聯用中和劑法與薄膜過濾法，加入硫酸鎂前，先加入中和劑充分混勻供試品溶液。4）沖洗濾膜的過程中，理論上沖洗量越大更能消除抑菌性，但考慮到實際操作的瑣碎，本著簡易便捷、快速準確的原則，選取300 mL為適宜沖洗量，可少量多次沖洗，每次沖洗50～100 mL，以達到最理想效果［14］。5）沖洗過程中，需要邊振搖邊沖洗，從而使藥物充分洗脫［15］。

本研究中開展薄膜過濾法前，為探尋最合適的沖洗量及硫酸鎂的體積分數，以枯草芽孢桿菌為敏感菌，加入3種濃度的硫酸鎂，再分別以3種沖洗量做對比。結果發現，當硫酸鎂體積分數為0.5%和1.0%時，試驗菌回收比大多符合標準。實際操作過程中，由于考慮薄膜過濾法帶來的煩瑣操作，且對比發現0.5%硫酸鎂為破膠劑時濾過更容易。故擇優選取以0.5%硫酸鎂作為破膠劑，300 mL為沖洗量，作為甲硝唑凝膠薄膜過濾法的條件。

試驗過程中發現，采用常規法時霉菌和酵母菌總數的回收比符合規定，在實際操作中，僅制備1次供試液進行檢驗最合理，故采用供試品溶液Ⅲ，再次進行霉菌和酵母菌總數的回收試驗，驗證霉菌和酵母菌總數的測定亦可通過常規法進行檢測。

綜上所述，本研究中利用硫酸鎂與凝膠中的卡波姆（丙烯酸交鏈聚合物）結合形成沉淀，從而達到破膠的目的。取上清液，則可以順利通過微孔濾膜，經沖洗后，可有效去除甲硝唑凝膠的抑菌作用。該種方法可為含抗感染藥物凝膠制劑的微生物限度檢查的研究提供參考。