高效液相色譜法同時測定阿木日-6膠囊中大黃素和大黃酚含量*

薩日古拉，牧其爾，烏漢其木格，昂格樂瑪，亞 男，錫林其其格△

（1.內蒙古醫科大學民族醫藥創新中心，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古國際蒙醫醫院創新蒙醫藥工程實驗室，內蒙古 呼和浩特 010065）

蒙藥阿木日-6膠囊源于內蒙古民間經典驗方，由土木香、大黃、山柰、寒水石（煅）、訶子、堿面（制）組成，是蒙醫臨床治療消化不良的主方［1-4］。2020年版《中國藥典（一部）》中收載的六味安消膠囊由藏木香、大黃、山柰、訶子、北寒水石（煅）、堿花組成，具有和胃健脾、消積導滯、活血止痛功效，臨床多用于治療胃痛脹滿、消化不良、便秘及痛經等癥［5-11］。雖然兩藥的處方大致相同，但前者用土木香，后者用藏木香，且兩種制劑中各藥味的比例也不同［12-13］。為有效控制阿木日-6膠囊的質量，本研究中建立了同時測定制劑中大黃素和大黃酚含量的高效液相色譜（HPLC）法［14-15］。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BT25S型電子天平、BSA224S型電子天平、BSA423S型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Thermo Ultimate 3000 LC-20AT型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.2 試藥

阿木日-6膠囊（內蒙古自治區國際蒙醫醫院蒙藥制劑中心，批號分別為20170325，20160117，20160417）；大黃酚對照品（批號為110796-201621），大黃素對照品（批號為110756-201512），均購于中國食品藥品檢定研究院，含量均大于98%；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（42∶23∶35，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：分別取大黃素對照品5.44 mg、大黃酚對照品10.01 mg，精密稱定，各置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得單一對照品溶液。

供試品溶液：取樣品3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲（功率200 W，頻率40 kHz）處理60 min，放冷，再次稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液Ⅰ；取樣品3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸（10∶1，V/V）混合溶液25 mL，稱定質量，置80℃水浴中加熱回流60 min，再次稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液3 mL，置5 mL容量瓶中，加2%氫氧化鈉溶液1 mL，再加甲醇定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液Ⅱ。

陰性對照品溶液：按阿木日-6膠囊處方和工藝制備缺大黃的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：取上述單一對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果理論板數按大黃酚峰計應不低于3 000；分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

專屬性試驗：取上述單一對照品溶液、陰性對照品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果陰性對照品溶液在與對照品溶液色譜保留時間相同處無干擾峰，表明專屬性良好。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Emodin 2.ChrysophanolA.Emodin reference solution B.Chrysophanol reference solutionC.Test solution D.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關系考察：取大黃素對照品3.38 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，倍比稀釋，制成質量濃度分別為1.69，3.38，6.76，13.52，27.04，54.08，135.20 μg/mL的大黃素系列對照品溶液，精密量取10 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積；取大黃酚對照品9.49 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，分別取0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μg或ng）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得大黃素和大黃酚回歸方程分別為Y1=0.684 4X1-0.735 8（r=0.999 8，n=7）和Y2=0.088 1X2+0.166 1（r=0.999 9，n=7）。結果表明，大黃素和大黃酚的進樣量分別在16.9～1 352.0 μg和47.45～1 898.0 ng范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取2.2項下供試品溶液Ⅰ和Ⅱ（批號為20170325）各適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果游離大黃素、游離大黃酚、總大黃素、總大黃酚峰面積的RSD分別為1.66%，1.99%，0.81%，0.96%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液1，2（批號為20170325）各適量，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果游離大黃素、游離大黃酚、總大黃素、總大黃酚峰面積的RSD分別為1.04%，1.12%，0.83%，0.59%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：稱取樣品（批號為20170328）適量，精密稱定，共6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果游離大黃素、游離大黃酚、總大黃素、總大黃酚平均含量分別為0.075 1，0.194 5，0.194 1，0.546 8 mg/g，RSD分別為1.66%，1.99%，0.81%，0.96%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量樣品（批號為20170325）適量，共6份，分別加入一定質量濃度的對照品溶液適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of content determination of the four components in samples（mg/g，n=3）

由表2可知，3批樣品含大黃以總大黃素及總大黃酚的總量計均大于0.7 mg；結合蒽醌類成分以大黃素及大黃酚的總量計均大于0.45 mg。以實測值下浮20%（參照2007年版《內蒙古蒙藥制劑規范》），可暫定本品每1 g含大黃不得少于0.56 mg，結合蒽醌類成分不得少于0.36 mg。

3 討論

蒙藥阿木日-6膠囊是蒙古民族藥方中廣泛使用的方劑，處方安全有效，臨床應用較廣泛，藥效確切［5-11］。2020年版《中國藥典（一部）》收載的六味安消散由藏木香、大黃、山柰、北寒水石、訶子，堿花組方，處方略有不同。本研究中參考六味安消散含量測定方法檢測總大黃素、總大黃酚、游離大黃素、游離大黃酚的含量（后兩種成分超聲提取即可）。大黃素和大黃酚是以與其他化合物結合的形式存在，需加入鹽酸后加熱回流提取。六味安消散的藥典含量測定方法中，以甲醇-鹽酸（10∶1，V/V）在80℃水浴中加熱回流30 min提取；大黃藥典的含量測定方法中，先用甲醇加熱回流1 h，加8%鹽酸溶液再超聲處理2 min，再加三氯甲烷加熱回流1 h。本研究中參考前法，以甲醇-鹽酸（10∶1，V/V）加熱回流，且經方法學驗證，該方法簡單、操作簡便。

綜上所述，本研究中所建立的方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性均較好，可用于同時測定阿木日-6膠囊中大黃素和大黃酚的含量。