毛細管電泳法測定魚肉組織中的諾氟沙星和環丙沙星

田慧勇，李曉娜*，楊宇燕，黃藤波，李廣鵬，甘慧

（1.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東 深圳 518102；2.廣東省檢迅檢測科技有限公司，廣東 東莞 523843；3.深圳市深業航天食品與環境檢測科技有限公司，廣東 深圳 518100；4.深圳市匯知科技有限公司，廣東 深圳 518101）

氟喹諾酮類藥物（FQs）是人造非甾體抗生素[1]。諾氟沙星（NOR）用于治療由彎曲桿菌、大腸桿菌、志賀氏菌和霍亂弧菌引起的疾病，也可治療淋病、眼部感染和尿路感染[2]。環丙沙星（CIP）則用于治療全身感染，包括尿路、呼吸道、胃腸道和皮膚感染，其通過抑制細菌DNA螺旋酶的一個亞蛋白來影響細菌的生長和繁殖[3]。這些喹諾酮類藥物也經常被用作飼料添加劑[4]，其廣泛使用對人類的健康構成潛在危害，如耐藥菌株的出現或可誘發癌癥[5]。對藥物殘留進入食物鏈并導致細菌耐藥性的擔憂促使歐盟和中國建立了各類抗生素的最大殘留水平[6]。

近年來已報道了幾種測定諾氟沙星和環丙沙星的方法，其中包括高效液相色譜法[7]、流動注射化學發光法[8]、電化學方法[9]和分光光度法[10]。高效液相色譜法系統復雜、維護復雜、樣品用量大、試劑昂貴限制了其應用?；瘜W發光法和分光光度法不能用于測定復雜生物樣品中的氟喹諾酮類藥物，因為它們分離效率太低。近年來毛細管電泳法因其簡單、高效、對溶劑和樣品的要求不高、成本相對較低，在生物樣品的定量分析中引起了廣泛關注[11]。通過液-液萃取或固相萃?。⊿PE）的方法處理樣品，過程復雜、耗時且需要大量有機溶劑?；|固相分散前處理方法（MSPD）基于SPE，其中基質的均勻分散體與合適的固體吸附劑（硅膠、硅藻土、氧化鋁、C18等）混合。該方法已成功從魚肉組織中提取諾氟沙星和環丙沙星，與其他方法相比MSPD需要的分析時間更短、樣本量更小、消耗溶劑更少[12]。

本試驗建立了一種同時測定魚肉組織中諾氟沙星和環丙沙星殘留的毛細管電泳（CZE）方法。MSPD用于從魚肉組織中提取諾氟沙星和環丙沙星。本試驗重點是MSPD前處理及毛細管電泳分離效率的參數優化，最后將該方法用于實際樣品中諾氟沙星和環丙沙星的分析，取得了較好的結果。

1 材料和儀器

1.1 主要試劑與材料

諾氟沙星和環丙沙星標準品購自中國標準物質研究中心。甲醇（AR）、甲苯（AR）、氯仿（AR）和乙腈（AR）夠自北京化工廠，硼酸（H3BO3）（AR）和氫氧化鈉（NaOH）（AR）購自天津化學試劑總廠，硅藻土（Florisil，200目）、二氧化硅（200目）購自中國醫藥生物制品研究所。YWG-C18-（C18-）和YWG-C8-（C8-）鍵合二氧化硅材料（表面積300 m2/g、平均孔徑10μm）購自中科安泰科技有限公司。草魚購自深圳市寶安區某超市。

1.2 主要儀器設備

冷凍離心機購自美國eppendorf；M3 basic渦旋儀和Topolino磁力攪拌購自德國IKA；TP-213 電子天平購自美國 DENVER Instrument；DHG-9140A 電熱恒溫干燥箱購自上海精宏實驗設備有限公司；DF-101S恒溫加熱器購自鞏義市予華儀器有限責任公司；毛細管電泳儀（型號：PA800）購自美國Beckman Coulter；該儀器配備紫外線（UV）檢測器，自帶32K 8.0軟件進行數據采集和儀器控制。Milli-Q水凈化系統購自美國Millipore，18.2 MΩ·cm超純水經0.22μm過濾膜過濾使用。

2 試驗方法

2.1 固相萃取材料的制備

先將Florisil、二氧化硅、C18和C8在650℃下烘焙后干燥5小時，再于100℃下干燥2小時后，儲存于干燥器中以備將來使用。

2.2 MSPD方法前處理

MSPD的步驟參見文獻[13]。約0.02 g草魚腹部肉在2 mL NaCl（1 mol/L）中均質，轉移到玻璃砂漿中，然后浸泡在適量的標準溶液中。10分鐘后將1.0 g C18（分散吸附劑）與樣品混合。將均勻混合物裝入預先包裝有0.2 g C18顆粒的針筒中。用3.0 mL甲醇-H2O（1∶19，v/v）沖洗針筒，并用3.0 mL乙腈洗脫。洗脫液在50℃下氮氣旋轉蒸發。干殘渣用200 μL流動相緩沖液復溶后，上機待測。

2.3 CE色譜條件

未處理的的石英毛細管（60 cm×75 μm）需進行活化，用0.1 mol/L NaOH溶液沖洗30分鐘，Milli-Q純凈水沖洗30分鐘，然后用流動相緩沖液浸泡30分鐘。40 mmol/L的硼酸溶液用NaOH調節至pH 8.5作為流動相，施加16 kV的電壓進行分離。通過液體冷卻系統使毛細管的溫度保持在25℃。在1.0 psi的壓力下2 秒鐘將緩沖液注射，在280 nm紫外檢測器中進行檢測。

3 結果與討論

3.1 MSPD前處理優化

在萃取前將諾氟沙星和環丙沙星添加到空白的魚肉組織中，使其終濃度為10 μg/g。均質、混合后研究四種吸附材料（Florisil、二氧化硅、C8和C18）的回收率，結果見表1。四種吸附劑性能的比較表明，C18的吸附效率顯著優于二氧化硅、Florisil和C8，其原因可能為C18的極性與目標分析物相似。C18作為分散吸附劑時，兩種目標分析物的回收率最高，分別為87.8%和92.3%。當使用其他吸附劑時，兩種目標分析物的回收率較低，且干擾分析物檢測的峰較多。因此，選擇C18作為最佳分散吸附劑。

表1 不同吸附劑對諾氟沙星和環丙沙星回收率的影響(n＝3)

由于MSPD前處理是一個復雜的過程，并且根據樣品的性質，如極性、溶解度、pKa等，應仔細選擇洗滌和洗脫溶劑。以甲苯、氯仿、甲醇和水為備選洗滌溶劑，研究了MSPD中的洗滌步驟，以提高MSPD的選擇性并降低交叉反應。以甲醇-H2O（1∶19，v/v）為洗滌溶劑時，洗滌效果最好。當甲醇-H2O的體積小于3.0 mL時，觀察到內源性成分的干擾。然而當甲醇-H2O的體積大于3.0 mL時回收率降低。因此選擇3.0 mL甲醇-H2O（1∶19，v/v）為洗滌劑。此外還研究了水、甲醇和乙腈等洗脫溶液，以3.0 mL乙腈為洗脫液，諾氟沙星和環丙沙星的回收率最佳。

3.2 色譜條件的優化

電解質濃度對分離性能有顯著影響，因為它會影響焦耳熱、電滲流量、離子強度、電解質粘度以及毛細管中產生的電流。因此電解質濃度會影響保留時間和峰面積。對不同硼酸鹽濃度（10 ～70 mmol/L）進行了研究，結果見圖1。將緩沖溶液的pH值調整至8.5，并將兩種目的分析物的濃度為10.0 μg/g時，當硼酸鹽濃度從10 mmol/L變化至40 mmol/L，分析物的峰面積逐漸增加；當硼酸鹽濃度高于40 mmol/L時，峰面積顯著減小，分析時間顯著增加，保留時間延長。因此最佳硼酸鹽濃度為40 mmol/L。

圖1 緩沖液濃度對峰面積的影響

由于諾氟沙星（pKa1 6.1，pKa2 8.5）和環丙沙星（pKa1 6.1，pKa2 8.7）是兩性離子化合物[20]，緩沖液pH不僅影響電滲流量，還會影響兩種分析物的存在形式。本試驗研究了緩沖液pH值對兩種分析物分離的影響，結果見圖2。當硼酸鹽的濃度為40 mmol/L時，兩種分析物的濃度為10.0 μg/g時，結果表明峰面積隨著pH值從6.5～8.5增加而增加。然而當pH值大于8.5時，峰面積幾乎不變，但保留時間延長，原因是分析物以陰離子的形式存在。當pH值高于8.5時，它們在280 nm波長處具有最大的吸光度。因此在后續研究中緩沖液流動相的pH值為8.5。

圖2 緩沖液pH值對峰面積的影響

在10～20 kV范圍內對電壓的優化。隨著外加電壓的增加，保留時間縮短，峰面積增加，但分辨率降低，實驗選擇了16 kv的外加電壓，該電壓下具有良好的靈敏度和保留時間。

表2 諾氟沙星和環丙沙星在魚肉組織中的標準曲線、檢出限和定量限

3.3 標準曲線、檢出限和定量限

通過在空白魚肉組織樣品中添加不同濃度的諾氟沙星和環丙沙星來繪制標準曲線。在0.10～500 μg/g的濃度范圍內，獲得了魚肉組織中諾氟沙星和環丙沙星的線性校準曲線，相關系數R2分別為0.9994和0.9986。諾氟沙星和環丙沙星的檢出限（LOD）（信噪比為3，S/N＝3）分別為0.04 μg/g和0.03 μg/g，諾氟沙星和環丙沙星的定量限（LOQ）（信噪比為3，S/N＝10）分別為0.12 μg/g和0.10 μg/g。歐盟確定在肉類中的諾氟沙星和環丙沙星的最大殘留限量為100 μg/kg[14]。因此，該方法具有足夠的靈敏度，可以應用于魚肉組織中。

3.4 樣本分析

將不同濃度（0.50 μg/g、2.00 μg/g和10.00 μg/g）的諾氟沙星和環丙沙星加標到空白魚肉組織中，考察了該方法的回收率和精密度。表3總結了日內和日間精密度和準確度實驗的結果。在本試驗中，諾氟沙星的精密度在中濃度和高濃度水平下通常小于5.6%，在低濃度水平下不超過6.8%，回收率始終在86.4%到105.2%之間。環丙沙星在中、高濃度水平下的精密度＜5.1%，在低濃度水平下的精密度不超過6.2%，回收率在90.1%～103.6%之間。該方法的回收率和精密度都優于ELISA方法。圖3顯示了從空白和加標魚肉組織樣品中的毛細管電泳譜圖。

圖3 毛細管電泳譜圖

表3 諾氟沙星和環丙沙星在魚肉組織中的精密度和回收率（n=9）

4 結論

本試驗建立了一種利用MSPD前處理方法并通過毛細管電泳法測定魚肉組織中諾氟沙星和環丙沙星的方法，研究了樣品前處理方法的條件。對毛細管電泳條件也進行了參數優化：選擇合適的緩沖液濃度、pH值和電壓等；并對方法的線性關系、檢出限、加標回收等進行了系統的考察。試驗表明：該方法具有前處理簡單、污染小、檢測結果準確、可靠等優點，可以用于大批量魚肉制品中諾氟沙星和環丙沙星殘留的檢測，為國家標準的制定提供技術參考。