基于Ngn3和Caspase-3探討姜黃素對宮內發育遲緩仔鼠胰腺發育及糖脂代謝的影響

劉曉玲，雷小平，張蓮玉

（西南醫科大學附屬醫院新生兒科，四川 瀘州 646000）

宮內發育遲緩（intrauterine growth restriction，IUGR）是指胎兒出生體質量降低平均體質量2個標準差，是圍產期的主要并發癥，是導致圍產兒死亡的主要原因，IUGR患兒伴隨體能及智力發育異常[1]。尋找適宜的治療方法積極改善IUGR具有重要的研究意義。IUGR病因復雜多樣，胎盤功能紊亂、微循環障礙是IUGR的主要病理[1-2]。基于中醫活血化瘀與現代醫學疏通微循環相通的原理[3]，本研究選擇活血化瘀中藥姜黃來源的單體為研究對象。姜黃素（curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃（curcuma longaL.）根莖中提取的一種酚性色素，是有效的藥物單體，具有抗氧化、抗炎、抗凝、降血脂、降血糖、抗腫瘤、保肝及增加免疫功能等作用，且毒性低[4-5]。本研究通過構建IUGR大鼠模型，觀察姜黃素對其治療作用及機制，以期為臨床治療IUGR藥物的選擇提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級無交配史8~10周齡SD大鼠，雄性10只，雌性20只，體質量240~270 g，均購自廣東省醫學實驗動物中心，動物質量合格證號：2019A008，生產許可證號：SCXK（粵）2019-0010。動物飼養管理均在本院動物實驗房內進行，動物實驗的實施嚴格遵照《實驗動物護理和使用指南》。

1.2 藥物、試劑與儀器姜黃素（分子量：368.385；分子式：C21H20O6同分異構體），購自美國Sigma公司，批號：C1386。總膽固醇（TC）、膽固醇（CHO）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（上海莼試生物）；免疫組織化學EliVisionTM試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法檢測試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司）；兔抗鼠Ngn3單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體（美國CST公司）；兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體（碧云天生物技術研究所）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG[翌圣生物科技（上海）股份有限公司]。蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；熒光顯微鏡（北京測維光電儀器廠）。

1.3 建模方法按照雌雄2∶1合籠，交配成功后，母鼠采用全程日糧限飼饑餓法建立IUGR模型[6-7]。母鼠分為正常懷孕大鼠（5只）和實驗懷孕大鼠（15只），正常懷孕大鼠受孕后第1天采用基礎飼料喂養，實驗懷孕大鼠孕后第1天給予正常懷孕大鼠50%的進食量直至自然分娩。所生新生仔鼠出生體質量在正常新生仔鼠平均體質量減去2倍標準差以下者為IUGR新生鼠。

1.4 分組與干預方法選擇21 d仔鼠進行斷奶分組，隨機分為健康組（健康仔鼠）、IUGR組（IUGR仔鼠）、健康+姜黃素組（健康仔鼠+基礎飼料+400 mg/kg姜黃素）、IUGR+姜黃素組（IUGR仔鼠+400 mg/kg姜黃素），每組10只。健康組及IUGR組按照基礎飼料喂養，健康+姜黃素組及IUGR+姜黃素組飼喂基礎飼料+400 mg/kg的姜黃素[7]，基礎飼料質量百分比：蛋白質（22.70%）、粗脂肪（5.54%）、賴氨酸（1.25%）、蛋氨酸（0.40%）、鈣（1.24%）、磷（1.07%）。飼養12周。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 血糖、血脂指標檢測各組仔鼠干預結束后次日清晨稱質量后采集尾部靜脈血，采用血糖儀快速檢測血糖。再抽取全血，靜置5 min后，以3 000 r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，收集血清，采用相關試劑盒檢測TC、CHO、LDL-C及HDL-C水平。

1.5.2 組織保本采集采血后將各組仔鼠全部固定于手術臺上，以2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后處死。剪開腹腔，快速分離胰腺，生理鹽水沖洗，放入4%甲醛中用于HE染色、TUNEL染色及免疫組織化學染色，置于液氮中用于免疫印跡實驗。

1.5.3 HE染色法觀察仔鼠胰腺發育情況將胰腺組織浸泡于10%甲醛溶液中固定過夜，石蠟包埋后4 μm切片，二甲苯脫蠟后100%-95%-85%及75%乙醇進行逐層脫水，蘇木素染色，鹽酸（1%）處理，伊紅復染，100%-95%-85%及75%乙醇脫水。封片后顯微鏡下觀察胰腺組織形態。

1.5.4 TUNEL染色法觀察仔鼠胰腺組織胰島β細胞凋亡情況取胰腺組織石蠟切片，具體步驟按TUNEL檢測試劑盒說明書進行。封片后，熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞呈綠色，每張切片選擇5個非重疊視野，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞個數/總細胞個數×100%。

1.5.5 免疫組織化學法檢測仔鼠胰腺組織Ngn3及Caspase-3陽性細胞數取胰腺組織石蠟切片脫蠟，經50%、80%、90%乙醇梯度脫水，二甲苯（Ⅰ）和二甲苯（Ⅱ）透明，各1～2 min；以3%過氧化氫處理15 min，PBS洗2～3次，各5 min；pH6.0檸檬酸鹽抗原修復，水浴消除內源性過氧化物酶活性，用含3%正常山羊血清的PBS孵育20 min；加入兔抗鼠Ngn3（1∶300稀釋）、Caspase-3（1∶500稀釋）等一抗，4℃孵育過液；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1∶300），37℃孵育30 min；DAB法顯色；依次干燥，95%乙醇、無水乙醇脫水，透明、中性樹膠封片。顯微鏡觀察，取5個視野，每個視野計數100個細胞，棕褐色均染或顆粒判為陽性細胞，Ngn3及Caspase-3陽性均表達于細胞質中，計算陽性細胞百分比。

1.5.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測仔鼠胰腺組織Ngn3、Caspase-3蛋白表達水平取胰腺組織加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液裂解，離心取上清液，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量法測定蛋白濃度。將蛋白調整至等濃度后，用電泳儀進行電泳，條件為濃縮膠80 V，分離膠120 V。電泳完成后進行轉膜。轉膜終止后，用PBS緩沖液沖洗5 min。麗春紅染膜，觀察轉膜效果。然后用PBS將麗春紅沖洗干凈，用封閉液封閉1.5 h，加入稀釋的Ngn3（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、GAPDH等一抗，4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶5 000），孵育90 min后PBS洗滌。電化學發光（ECL）試劑盒曝光顯影3 min。應用ImageJ軟件分析Ngn3、Caspase-3蛋白與GAPDH灰度值的比值，表示Ngn3和Caspase-3的蛋白相對表達量。

1.6 統計方法采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組仔鼠血糖及血脂代謝水平比較表1結果顯示：健康組和健康+姜黃素組2組間空腹血糖、TG、CHO、LHL-C及HDL-C水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與健康組比較，IUGR組仔鼠空腹血糖、TG及LDL-C水平均升高，HDL-C水平降低（均P＜0.05）；與IUGR組比較，IUGR+姜黃素組仔鼠空腹血糖、TG及LDL-C水平降低，HDL-C水平升高（均P＜0.05）。各組仔鼠CHO水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明姜黃素可改善IUGR仔鼠糖脂代謝。

表1 各組仔鼠血糖及血脂代謝水平比較Table 1 Comparison of the blood glucose and glucolipid metabolism levels of newborn rats among various groups （±s，mmol·L-1）

表1 各組仔鼠血糖及血脂代謝水平比較Table 1 Comparison of the blood glucose and glucolipid metabolism levels of newborn rats among various groups （±s，mmol·L-1）

①P＜0.05，與健康組比較；②P＜0.05，與健康+姜黃素組比較；③P＜0.05，與IUGR組比較

組別健康組健康+姜黃素組IUGR組IUGR+姜黃素組F值P值鼠數/只10 10 10 10空腹血糖5.84±0.64 5.71±0.67 7.84±0.80①②6.30±0.58①②③20.860＜0.001 TG 0.39±0.09 0.41±0.11 0.89±0.20①②0.62±0.15①②③26.230＜0.001 CHO 1.38±0.54 1.42±0.48 1.72±0.25 1.55±0.33 1.355 0.272 LDL-C 0.65±0.20 0.70±0.18 0.91±0.25①②0.83±0.24①②③2.942 0.046 HDL-C 0.66±0.20 0.68±0.18 0.38±0.15①②0.54±0.13①②③6.810 0.001

2.2 各組仔鼠胰腺發育情況比較圖1結果顯示：健康組和健康+姜黃素組仔鼠胰腺組織排列緊密，胰島、腺泡及導管結構清晰，胰島數目較多；IUGR組仔鼠胰島體積減小，數目較少、結構松散且分布不規則；與IUGR組比較，IUGR+姜黃素組仔鼠胰島數目增加、面積增大、結構較清晰飽滿。表明姜黃素可以改善IUGR仔鼠胰腺病理損傷，促進胰腺發育。

圖1 各組仔鼠胰腺組織形態比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological features of newborn rat pancreatic tissues among various groups（by HE staining，×200）

2.3 各組仔鼠胰腺組織中胰島β細胞凋亡程度比較圖2結果顯示：健康組、健康+姜黃素組、IUGR組及IUGR+姜黃素組仔鼠胰腺組織胰島β細胞凋亡率分別為（3.42±0.50）%、（3.11±0.54）%、（21.22±2.55）%及（14.53±2.04）%，多組間比較存在差異（F=280.500，P＜0.001）。進一步比較：健康組和健康+姜黃素組2組間胰島β細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與健康組比較，IUGR組胰島β細胞凋亡率升高（P＜0.05）；與IUGR組比較，IUGR+姜黃素組胰島β細胞凋亡率降低（P＜0.05）。表明姜黃素可以抑制IUGR仔鼠胰島β細胞凋亡。

圖2 各組仔鼠胰腺組織中凋亡胰島β細胞分布情況比較（TUNEL法，×200）Figure 2 Comparison of the islet β cell apoptosis in newborn rat pancreatic tissues among various groups（by TUNEL method，×200）

2.4 各組仔鼠胰腺組織中Ngn3、Caspase-3陽性細胞數比較表2、圖3、圖4結果顯示：健康組和健康+姜黃素組2組間胰腺組織Ngn3及Caspase-3陽性細胞數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與健康組比較，IUGR組胰腺組織Ngn3陽性細胞數降低，Caspase-3陽性細胞數升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與IUGR組比較，IUGR+姜黃素組Ngn3陽性細胞數升高，Caspase-3陽性細胞數降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。表明姜黃素可以促進IUGR仔鼠胰腺組織中胰腺發育相關蛋白Ngn3表達及抑制凋亡效應蛋白Caspase-3陽性表達。

圖4 各組仔鼠胰腺組織中Caspase-3陽性細胞分布情況比較（免疫組織化學法，×200）Figure 4 Comparison of the distribution of Caspase-3 positive cells in newborn rat pancreatic tissues among various groups（by immunohistochemical method，×200）

表2 各組仔鼠胰腺組織中Ngn3、Caspase-3陽性細胞數比較Table 2 Comparison of the number of Ngn3 and Caspase-3 positive cells in newborn rat pancreatic tissues among various groups（±s）

表2 各組仔鼠胰腺組織中Ngn3、Caspase-3陽性細胞數比較Table 2 Comparison of the number of Ngn3 and Caspase-3 positive cells in newborn rat pancreatic tissues among various groups（±s）

①P＜0.05，與健康組比較；②P＜0.05，與健康+姜黃素組比較；③P＜0.05，與IUGR組比較

組別健康組健康+姜黃素組IUGR組IUGR+姜黃素組F值P值鼠數/只10 10 10 10 Ngn3陽性細胞數/個15.65±1.50 16.20±1.62 5.22±0.71①②11.34±1.23①②③149.600＜0.001 Caspase-3陽性細胞數/個4.05±0.70 3.86±0.85 20.41±3.40①②13.80±2.04①②③153.400＜0.001

圖3 各組仔鼠胰腺組織中Ngn3陽性細胞分布情況比較（免疫組織化學法，×200）Figure 3 Comparison of the distribution of Ngn3 positive cells in newborn rat pancreatic tissues among various groups（by immunohistochemical method，×200）

2.5 各組仔鼠胰腺組織Ngn3、Caspase-3蛋白表達水平比較表3、圖5結果顯示：健康組和健康+姜黃素組2組間胰腺組織Ngn3、Caspase-3蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與健康組比較，IUGR組胰腺組織Ngn3蛋白表達水平降低，Caspase-3蛋白表達水平升高（均P＜0.05）；與IUGR組比較，IUGR+姜黃素組胰腺組織Ngn3蛋白表達水平升高，Caspase-3蛋白表達水平降低（均P＜0.05）。表明姜黃素可以促進IUGR仔鼠胰腺組織中胰腺發育相關蛋白Ngn3表達及抑制凋亡效應蛋白Caspase-3的表達。

表3 各組仔鼠胰腺組織Ngn3及Caspase-3蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of the protein expression levels of Ngn3 and Caspase-3 in newborn rat pancreatic tissues among various groups（±s）

表3 各組仔鼠胰腺組織Ngn3及Caspase-3蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of the protein expression levels of Ngn3 and Caspase-3 in newborn rat pancreatic tissues among various groups（±s）

①P＜0.05，與健康組比較；②P＜0.05，與健康+姜黃素組比較；③P＜0.05，與IUGR組比較

組別健康組健康+姜黃素組IUGR組IUGR+姜黃素組F值P值鼠數/只10 10 10 10 Ngn3蛋白相對表達量1.50±0.22 1.63±0.25 0.52±0.08①②0.89±0.17①②③74.460＜0.001 Caspase-3蛋白相對表達量1.02±0.14 0.95±0.20 2.41±0.45①②1.55±0.32①②③49.830＜0.001

圖5 各組仔鼠胰腺組織Ngn3（A）、Caspase-3（B）蛋白的Western Blot電泳條帶圖Figure 5 Western Blot analysis of protein Ngn3（A）and Caspase-3（B）in newborn rat pancreatic tissues in various groups

3 討論

正常胎兒發育過程中胰島β細胞凋亡時伴隨著胰島細胞新生，能夠通過引起胰島素的釋放而維持糖分的攝取，有利于胰腺發育及能量代謝。胚胎中晚期時存在胰島重構，宮內環境會對胰島功能發揮重要影響，當胎兒早期如出現營養不良，可導致胎兒胰島β細胞數目減少及功能異常[8]。近些年，隨著對宮內發育遲緩（IUGR）發生機制的研究，發現胰島功能不足可影響胎兒對糖分攝取不足，導致生長緩慢及體質量降低，且成年后IUGR伴隨糖尿病、肥胖及代謝綜合征的風險顯著升高，表明IUGR可對整個生命周期產生影響[9]。有研究[10]表明，母體營養不良的IUGR仔鼠胰島β細胞數目減少，可導致胰腺功能障礙。Caspase屬于特異性切割天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶，是細胞凋亡的主要調節因子。Caspase-3屬于家族成員凋亡執行因子，正常情況下Caspase-3以還原酶形式存在于機體細胞中，當IUGR發生后，其受到外界氧化應激等多種因素刺激后可被激活，發揮降解細胞核及細胞骨架誘導其胰島β細胞凋亡的作用[11-12]?，F代醫家多將“胰腺”歸屬于中醫“脾”的范疇[13]，而姜黃素歸脾、肝經，從此角度，亦可見選擇姜黃素治療IUGR胰腺發育存在一定的適配度。本研究結果顯示，IUGR組仔鼠胰島β細胞數目較健康組降低、胰腺組織Caspase-3表達較健康組升高，而IUGR+姜黃素組胰島β細胞數目較IUGR組增加、胰腺組織Caspase-3表達較IUGR組降低，表明姜黃素能夠減少IUGR仔鼠胰島β細胞凋亡，對胰腺損傷有改善作用。

在胰腺發育過程中，內分泌細胞產生于Ngn3標記的胰腺祖細胞[14]。胰腺發育相關蛋白Ngn3，屬于堿性螺旋-環-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）家族的轉錄因子，對胰腺內分泌細胞的發育及分化至關重要，且被認為是胰腺祖細胞的標志蛋白質[15]。Ngn3基因及其轉錄調控網絡對胰島的形成、成熟胰島細胞命運的維持起重要的調控作用[16]。Ngn3缺失小鼠存在內分泌功能障礙，主要表現為多種胰島細胞和內分泌前體細胞在各個階段都出現缺失，導致小鼠在圍生期發生死亡[17]。孕期全程低蛋白飲食的營養不良可致大鼠發生IUGR，并影響胰腺中Ngn3的表達，Ngn3表達下降可能導致胰腺β細胞分化及功能成熟障礙，進而導致胰腺發育不良，胰島數量及面積相應減少[18]。本研究結果顯示，IUGR組仔鼠胰腺組織Ngn3表達較健康組降低，IUGR+姜黃素組仔鼠胰腺組織Ngn3表達較IUGR組升高，表明姜黃素可上調Ngn3促進胰腺發育。

另外，經研究證實，IUGR是導致血糖升高及血脂水平異常的危險因素。當IUGR時，患兒血脂指標如TG、LHL-C等水平降低，隨著患兒生長，下丘腦食欲調節網絡出現異?？墒箶z食增加，出現血脂異常[19]。本研究結果顯示，IUGR組仔鼠血糖及血脂指標水平較健康組升高，IUGR+姜黃素組仔鼠上述指標則降低，表明姜黃素能夠改善IUGR仔鼠糖脂代謝紊亂。

綜上所述，IUGR仔鼠存在糖脂代謝紊亂、胰腺結構發育不良及胰島β細胞凋亡加劇，姜黃素能夠調節IUGR仔鼠糖脂代謝，這可能與其抑制凋亡效應分子Caspase-3表達，上調Ngn3活性有關。